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简介

表观遗传学领域的最新进展提供了对肿瘤发生机制的重要见解。癌症起源于遗传和表观遗传改变的积累。研究人员已经证明，表观遗传学变化发生在许多肿瘤类型的起始、进展和转移过程中。

表观遗传学的临床应用有两个主要领域：治疗学和生物标志物鉴定。由于表观遗传修饰是可逆的，因此它们作为预防和治疗医学的目标而受到关注。例如，血癌中的 DNMT 抑制剂和 HDAC 抑制剂已显示出积极的临床影响（Hatzimichael，2013 年）。

此外，表观遗传修饰有望作为早期癌症检测、预测、筛查和预后的生物标志物。

Diagenode 提供表观基因您可以信赖的染色质、DNA 和 RNA 分析组学服务。

液体活检

液体活检具有非侵入性优势，只需使用血液、粪便、尿液、痰液和唾液等体液即可作为研究肿瘤的极佳替代组织。原发性肿瘤将肿瘤物质释放到体液中，主要是循环肿瘤细胞、游离核酸（DNA 和 RNA）和细胞外囊泡。在液体活检中发现的表观遗传改变已显示出作为生物标志物的实用性，可用于许多类型癌症患者的早期检测、预后、监测和治疗反应评估。事实上，在液体活检样本中观察到的 DNA 甲基化模式的变化、组蛋白修饰物的改变（例如 H3K9me 的甲基化和 H3K27ac 的乙酰化）和 ncRNA 表达在包括结直肠癌在内的各种癌症中都有详细记录（Rodriguez-Casanova 2021）。

游离核酸

在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞释放DNA，mRNA和microRNA进入血液循环。这一过程通过细胞凋亡和坏死细胞死亡而发生，这是肿瘤的特征。

与非癌症患者不同，癌症患者的血浆或血清中 cfDNA 水平较高，并且可以在这些样本中检测到表观遗传改变.例如，来自多种癌症的 cFDNA 已显示出 K-ras 和 p53 突变 (Zhuang 2017)。此外，在 cfDNA 中观察到的 Septin 9 甲基化可能是早期结直肠癌检测的敏感生物标志物。还在来自痰（吸烟者常见的支气管分泌物）的 cfDNA 中检测到特定基因的高频率异常高甲基化。另一项研究分析了前列腺癌患者尿液沉渣中特定基因的甲基化，并显示了 DNA 甲基化生物标志物在区分早期和晚期前列腺癌方面的敏感性（Rodriguez-Casanova 2021）。

此外，许多非编码 RNA (ncRNA) 可以在液体活检中检测到。一些研究强调了 ncRNA 通过促进肿瘤细胞和基质中的差异基因表达在细胞间通讯中的作用。癌细胞中 ncRNA 表达的破坏也可能改变组蛋白 PTM 和 DNA 甲基化水平（Church 2014）。

cEVs

外泌体、微泡和凋亡小体可以高浓度存在于不同的体液中.这些囊泡在癌症中起着重要作用，因为它们促进细胞增殖和侵袭。这些小体可以通过超速离心、免疫亲和或沉淀分离。已在癌症患者的外泌体 DNA 和外泌体 nc​​RNA 中描述了分子改变 (Liu 2020)。

循环肿瘤细胞 (CTC)

DNA 甲基化分析也在从分离自血。数据表明，CTC 的甲基化分析代表了一种很有前途的非侵入性肿瘤检测方法。

方法学：检测方法液体活检中的表观遗传标记

DNA 修饰：甲基化和羟甲基化

DNA 甲基化模式的检测基于依赖于亚硫酸氢钠转化或依赖于免疫沉淀和甲基敏感限制酶的方法

查看我们的网络研讨会系列：\"生物流体中的 DNA 甲基化：从全基因组研究到靶向方法”，2021 年 3 月 11 日\"癌症检测中的血浆和尿液无细胞 DNA 甲基化组”，2020 年 10 月 1 日

基于 NGS 的全基因组亚硫酸氢盐方法允许评估液体活检中的整个甲基化组，从而发现癌症患者 cfDNA 的整个甲基化景观。

MCTA-seq（甲基化 CpG 串联扩增和测序）分析 cfDNA 中 CpG 岛的甲基化状态是可能的ed，并结合机器学习对结果进行分析。使用甲基化微阵列进行液体活检的全基因组水平。该方法利用亚硫酸氢盐转化的 DNA，并已应用于研究癌症患者的 cfDNA 和 CTC。基于甲基化微阵列和 NGS 的方法已被用于鉴定 cfDNA 中用于癌症检测的表观遗传生物标志物。例如，通过 MethylationEPIC 阵列对汇集的 cfDNA 样本中的约 850,000 个 CpG 进行的分析突出显示了 1,384 个差异甲基化的 CpG 位点，这些位点可将 CRC 患者与健康对照区分开来。 （Gaillardo-Gomez，2018 年）cfDNA 简化代表性亚硫酸氢盐测序 (cf-RRBS) 是分析液体活检中 cfDNA 甲基化组的一种经济高效的方法。在 cf-RRBS 中，cfDNA 在被甲基化不敏感的限制性内切酶 MspI 酶促消化之前被去磷酸化并测序。可以通过 5hmC 方法结合癌症患者的 cfDNA 获得全基因组羟甲基化谱NGS（Li et al., 2017）。

免疫沉淀方法

cfMeDIP-seq 这是一种基于无细胞甲基化 DNA 免疫沉淀和高通量测序的全基因组方法。特别是，cfMeDIP-seq 是一种基于区域的方法，可揭示长度至少为 100 bp 的基因组区域的甲基化状态。 cfMeDIP-seq 是一种低输入且敏感的方法，可用于多种肿瘤类型的早期和晚期检测。 （Shen 等人，2019 年）。甲基-CpG 结合 (MBD) 蛋白与 ddPCR (MBD–ddPCR) 这种位点特异性方法基于使用甲基结合结构域的免疫沉淀，可以检测 cfDNA 中的甲基化位点。

NGS 的意义

NGS 与机器学习的结合使得能够开发出基于约 100 万个 CpG 位点的测试，能够检测和定位 50 多种肿瘤类型。 (Liu M. C. et al., 2020)。另一个研究小组基于 9,223 hyperme 设计了靶向 NGS 检测从癌症基因组图谱 (TCGA) 中获得的甲基化 CpG 位点被证明可用于识别肿瘤类型 (Liu et al., 2018)。考虑到 10,613 个 CpG 位点的 PanSeer 分析允许检测五种癌症类型，无论起源组织如何。重要的是，该测定能够在标准诊断之前数年检测出无症状个体中是否存在癌症（Chen 等人，2020 年）。

组蛋白修饰和核小体定位

组蛋白修饰血液循环核小体表明它们也有助于癌症检测。例如，低水平的 H3K9me3、H4K20me3 和 H3K27me3 已被提议作为诊断结直肠癌的生物标志物（Gezer 等人，2015 年）。在循环核小体中检测到的不同翻译后修饰也被证明可用于筛选 (Rodriguez-Casanova 2021)。此外，CRC 患者体内高浓度的循环核小体与 dis缓解进展、治疗反应差和生存率降低。癌症患者的核小体水平是动态的，因此可用于实时指示对治疗的反应（Holdenrieder 等，2001）。

检测方法：

ChIP-无细胞核小体序列 (cfChIP-seq)。该方法能够捕获具有不同活性染色质标记的循环核小体，这些染色质标记维持修饰和表达模式的细胞源基因组分布。其他类似方法已用于量化与癌症患者血浆中循环无细胞核小体相关的组蛋白标记水平（Vad-Nielsen 等人，2020 年）。循环核小体的 ChIP-qPCR 可以检测单个基因中的组蛋白修饰测量 cfDNA碎片化。几项研究表明，所有细胞都可能主动释放 DNA 片段。在多种癌症中，血浆 cfDNA 片段已被证明在健康个体和癌症患者之间表现出不同的大小ts（Mouliere 等人，2018 年）。研究人员提出将 cfDNA 片段化模式作为早期癌症检测的表观遗传生物标志物。此外，cfDNA 片段化模式的分析已证明有助于早期检测和预测患者对免疫化疗的反应。粪便中存在的不同长度的 DNA 片段也被用作区分癌症患者和健康患者的好工具。这些方法需要从不同类型的液体中输入非常低的 cfDNA，从而能够及早发现癌症（Mouliere 等人，2018 年）。最近提出了其他全基因组片段化方法，例如早期截取片段的 DNA 评估 (DELFI)（Cristiano 等人，2019 年）。

非编码 RNA

研究已经确定了循环 miRNA 特征，用于具有高灵敏度和特异性的早期癌症检测。血液中不同 miRNA 的水平也可以提供有关患者疾病阶段的信息，并代表一种早期发现复发和评估治疗反应的宝贵工具。例如，miR-21 的过表达与促进结直肠癌肿瘤发病机制的相关特定通路的激活有关 (Xiong et al., 2013)。此外，最近的转录组学分析揭示了 miRNA、lncRNA 和其他 ncRNA 的癌症特异性表达特征（Song 等人，2020 年）。

微阵列和 NGS 已被用于液体活检，以检测多种类型的癌症ncRNA，包括 miRNA、lncRNA 和 circRNART-qPCR 和 ddPCR，允许以高灵敏度量化液体活检中特定 ncRNA 转录物的表达水平。

与 DNA 甲基化的关联：DNA 甲基化可能控制结直肠癌中 ncRNA 的表达水平肿瘤细胞。外泌体 miRNA（例如 miR-21 和 miR-139-3p）分析代表了一种有价值的诊断和预后工具。循环外泌体中 miRNA 的分析揭示了重要的策略

机会 - 从研究到转化生物标志物

将循环表观遗传生物标志物转化为临床环境需要大型多中心研究来证明其使用的临床益处.

选择正确的生物标志物：目前已鉴定出生物流体中的大量 DNA 甲基化生物标志物。研究人员必须确定应选择哪些进行进一步验证并引入筛选。与任何生物标志物研究策略一样，理想的生物标志物在不同人群中应该是高度敏感和特异的，而不管不同的病因、患者年龄、性别或肿瘤分期。生物标志物组：生物标志物组而不是单一生物标志物可以提高灵敏度和特异性癌症的早期检测、诊断、预防或预测。标准化协议 - 必须改进样品收集、处理和储存以提高可重复性。应努力根据表观遗传改变、循环元素或生物流体协调预分析和分析方案。选择最佳生物流体很重要——什么是正确的替代组织？一些表观遗传生物标志物在粪便中的检测比血浆更敏感。例如，SEPT9 甲基化，它在粪便和血浆中进行了评估，粪便结果更好。验证 - 早期检测研究网络（EDRN，美国）指南，生物标志物小组在\"实地”之前应遵循几个步骤，包括临床前研究阶段、临床试验的建立及其验证、生物标志物用于早期疾病检测的性能评估、生物标志物的筛选评估以及筛选的影响。已经针对用于早期癌症检测和筛查的基因表达微阵列、蛋白质组学和免疫学方法提出了指南。这些指南将有助于p 进一步开发新型癌症相关 DNA 甲基化生物标志物。成本 许多技术涉及基于 NGS 的方法，包括文库制备和生物信息学解释。然而，在未来，这些策略应该与更多调整成本和用户友好的生物信息学解决方案相关联。

参考文献

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