| 货号： | S311 |
| 供应商： | 研卉生物 |
| 数量： | 20 |
| 英文名： | SOD Assay Kit - WST |
| 规格： | 100 tests |
- SOD Assay Kit - WST是由日本Dojindo开发的检测超氧化物歧化酶（SOD）活性的试剂盒，它具有以下特点： 1、灵敏度高，结果准确可靠 2、操作简便，重复性好 3、采用96孔板检测，省时省力 4、可一次检测多个样品 5、采用WST染色方法，可以测定100% SOD抑制率 6、众多SCI论文支持 WST®：WST是Dojindo研究所的注册商标超氧化物歧化酶（SOD）能够催化超氧阴离子（O2•-）歧化，生成过氧化氢以及单质氧，是一种重要的抗氧化酶。哺乳动物细胞溶质中的SOD呈绿色，并且由两种亚单位构成，一种含有铜，另一种含有锌（Cu/Zn-SOD）。线粒体和细菌SOD为红紫色并含有锰（Mn-SOD）。E.coli含有Mn-SOD和Fe-SOD。为了测定SOD的活性，研究人员尝试了许多间接的或者直接的方法，其中，NBT的间接法最为常用，因为它很方便。但是，NBT法有几个缺点，例如生成的染料水溶性差，而且会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应。虽然cytochrome C法也常被用来做SOD检测，但它和超氧化物反应过于剧烈，不能测定低水平的SOD。SOD Assay Kit-WST®使用了Dojindo自己发明的易溶于水的噻唑盐：WST®-1（2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐），能够和超氧阴离子反应生成水溶性的染料，因此可以简便地进行SOD的检测。WST®-1与超氧阴离子反应的剧烈程度比cytochrome C小70倍；因此，它的检测灵敏度非常高，并且能够通过将样品用buffer稀释，使背景的吸光度最小化。WST®-1不会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应，因此，能够检测SOD100%的抑制率。WST®-1被超氧阴离子还原的比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被SOD所抑制（见下图）。因此，SOD或者SOD类似物的IC50(50%的抑制浓度)就能用比色法来测定。 SOD检测机理：
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WST®-1 甲臜的光谱： ![\"\"](\"http://www.dojindo.cn/uploads/FCKeditor/14.jpg\")
试剂盒内含：100 testsWST® Solution………..1 ml × 1管 Enzyme Solution………20 μl × 1管Buffer Solution……. 11 ml × 2 瓶 Dilution Buffer………. 10 ml × 1瓶 试剂盒内含：500 testsWST® Solution……… 5 ml × 1 瓶 Enzyme Solution…… 100 μl × 1 瓶Buffer Solution……… 100 ml × 1 瓶 Dilution Buffer……… 50 ml × 1 瓶 检测步骤1） 将20 μl 样品溶液或水加入到每个孔中。2） 按照表1所示，向各孔中加入WST® Working solution， Dilution buffer和Enzyme working solution。a)3） 在37℃下培养20分钟。b)4） 测定450 nm处的O.D.值a） 由于加入Enzyme working solution后立即会有超氧化物生成，需要用多通道移液器来加Enzyme working solution以缩短时间，减少各孔间的误差。b） 如果酶标仪具有控温功能，请将温度保持在37℃。 抑制率的计算和典型标准曲线SOD抑制活性(抑制率%)=｛[(Ablank 1-Ablank 3)-(Asample-Ablank 2)]/(Ablank 1-Ablank 3)｝×100Ablank 1：blank 1的吸光度Ablank 2：blank 2的吸光度Ablank 3：blank 3的吸光度Asample：样品孔的吸光度 样品溶液的制备细胞（贴壁细胞：9×106个，Leukocytes：1.2×107个）1. 用刮刀刮下细胞，4℃，2,000 g离心10分钟，弃上清。2． 用1 ml PBS 洗净细胞，随后4℃，2,000 g离心10分钟，弃上清。重复次步骤一次。3. 在-20℃下放置20分钟，再在37℃水浴10分钟。这个步骤重复两遍使细胞膜破损。4. 加入1 ml新的PBS，如果必要的话，在冰浴器上用超声降解细胞裂解物（60 W，0.5 s间隔，15分钟）。5. 在4℃，10,000 g下离心15分钟6. 移出上清液用PBS稀释，制成样品溶液。 植物或者蔬菜（200 mg）1. 加入1 ml蒸馏水，用带有研磨球的均质器使样品均匀。2. 用滤纸过滤，将滤液冻干。3. 测量冻干后的样品重量，然后用0.1 M的磷酸缓冲液（pH 7.4）溶解，制成样品溶液。 组织（100 mg）1. 用生理盐水清洗组织，尽可能将血除去。用纸巾将组织上的水分吸干，然后称重。2. 加入400-900 μl 蔗糖缓冲液（0.25 M 蔗糖，10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4），用Teflon匀浆机将样品匀浆。如果必要的话，在冰浴器上将样品超声破碎，（60 W，0.5 s间隔，15分钟）。3. 匀浆后的样品在4℃下，10,000 g离心15分钟，将上清液移入新的试管中。4. 用蒸馏水稀释上清液，制成样品溶液。 茶（抗氧化剂活性检测）1. 向10 g茶叶中加入60 ml水，静置2.5分钟。2. 将提取物用滤纸过滤一次，然后再用0.45 μm的过滤膜过滤一次。3. 将滤液用蒸馏水稀释，制成样品溶液。 红细胞或血浆1. 取2-3 ml抗凝处理后的血液（如最终浓度约为10 U/ml肝素钠）在4℃，600 g，离心10分钟。2. 用生理盐水稀释上清液，作为血浆样品。加生理盐水至沉淀中，制成等量的悬液。3. 将该悬液在4℃，600 g，离心10分钟，弃上清液。4. 加入等量的生理盐水重复步骤3两次。5. 在沉淀中加入4.0 ml蒸馏水，制成悬液。加入1 ml乙醇和0.6 ml氯仿。6. 将混合后的液体，盖紧盖子，在4℃用震荡器强烈震荡15分钟。7. 将混合液在4℃，600 g，离心10分钟，随后将上层的水乙醇层小心移入一支新的试管中。8. 取出0.1 ml的水乙醇层，将蒸馏水0.7 ml加入到里面。用0.25%的乙醇稀释，制成样本溶液。 胞外SOD（EC-SOD）1. 制备1支0.5 ml的Con A-sepharose 柱，用PBS平衡。2. 将组织匀浆的上清液过柱，并在室温下静置5分钟。3. 用总共10 ml的PBS洗柱。4. 加入1 ml 0.5 M的α-methylmannoside/PBS,收集洗出液。重复5次。5. 不用稀释，直接用洗出液进行后续的SOD检测。如果SOD的活性足够高，也可以用PBS稀释样品。 酒（抗氧化活性检测）1. 用0.45 μm的过滤膜过滤一次。2. 用蒸馏水稀释滤液，制成样品溶液。1 Unit是指样品中的还原性染料（如细胞色素C，WST?-1，NBT或XTT）与超氧阴离子之间的比色反应，50%被抑制时的点。比如，如果不含任何 SOD的样品溶液的O.D.值为1.0的话，那么另一个O.D.值为0.5的样品则被定义为具有1个单位的酶活性。可以使用这个单位来确定样品中的SOD 活性。因此，用不同染料或方法检测SOD活性，它们之间不具有可比性。
2.我能使用SOD标准品来确定样品溶液的SOD活性吗？可以。制备标准曲线（典型抑制曲线，见第31页），确定样品溶液的SOD活性。SOD bovine erythrocytes（CAS# 9054-89-1，EC 1.15.1.1）能够从sigma（catalog# S2525）购得。
3.是否可以用动力学法来测定SOD活性？可以。因为在20分钟内的生色比率是保持一致的，可以测量直线上升阶段5分钟内的斜率来测定SOD活性。
4.如果样品自身带有较深的颜色，这样的样品可以使用吗？可以。稀释样品可以减小干扰，将样品孔的O.D.值减去blank 2的O.D.值就可以扣除本底的颜色。但是，如果样品溶液的SOD活性过低，是不能检测出的。
5.如何能够制备更多的Dilution buffer？Dilution buffer为PBS。请按以下浓度配制：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.47 mM KH2PO4， 8.1 mM Na2HPO4，pH7.4。
6.使用该试剂盒能否分别检测Mn-SOD和Cu/Zn-SOD？可以。要单独检测Mn-SOD活性，可以添加KCN阻断Cu/Zn-SOD活性。向样品中加入1 mM的KCN可以完全阻断Cu/Zn-SOD活性。要测定Cu/Zn-SOD的活，可以用总的SOD活性减去Mn-SOD活性，就可以得到。
7.怎样保存样品？-80℃ 可以保存1年。
8.能否使用该试剂盒检测超氧化物阴离子的水平？不 必用这个试剂盒，可以使用WST?-1来检测超氧化物。但是，必须有一个检测样品溶液中超氧化物量的标准。因为超氧化物不稳定，而且会和其它物质反应，要 确定系统中生成的超氧化物的总量是比较困难的。试剂盒中的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系可以被用作检测每个样品中超氧化物相对生成量的标准。参考文献：
氧化还原状态的改变控制手霉素诱导HL-60白血病细胞凋亡中国药理学通报，2008,24(6),772～777呼吸上皮细胞在臭氧气液界面暴露后的氧化损伤效应研究环境与健康杂志, 2011,28(5),397-400Expression of Pyrococcus furiosus Superoxide Reductase in Arabidopsis Enhances Heat TolerancePlant Physiology, 2009,151,893–904Chemoprevention of Carcinogenic Progression to Esophageal Adenocarcinoma by the Manganese Superoxide …Clin. Cancer Res., 2007,13,5176-5182Nanoparticle-mediated delivery of superoxide dismutase to the brain: an effective strategy to reduce …The FASEB Journal, 2009, 23, 1384-1395Phase I Study of Copper-Binding Agent ATN-224 in Patients with Advanced Solid TumorsClin. Cancer Res., 2008, 14, 7526 - 7534Persistent Pain Is Dependent on Spinal Mitochondrial Antioxidant LevelsThe Journal of Neuroscience, 2009 , 29(1), 159 –168Reduction of Renal Superoxide Dismutase in Progressive Diabetic NephropathyJ. Am. Soc. Nephrol., 2009,20,1303–1313Overexpression of Glutathione Peroxidase With Two Isoforms of Superoxide Dismutase Protects Mouse Isl…Diabetes, 2005, 54, 2109 - 2116Manganese superoxide dismutase polymorphism affects the oxidized low-density lipoproteininduced apopt…European Heart Journal, 2008, 29, 1267–1274Development of insulin resistance and obesity in mice overexpressing cellular glutathione peroxidaseProc.Natl.Acad.Sci., 2004,101,8852-8857Increased Glutathione Biosynthesis Plays a Role in Nickel Tolerance in Thlaspi Nickel Hyperaccumulato…The Plant Cell, 2004,16,2176-2191Extracellular Superoxide Dismutase Accelerates Endothelial Recovery and Inhibits In-Stent Restenosis …J. Am. Coll. Cardiol., 2007,50,2249 - 2253An Abnormal Mitochondrial–Hypoxia Inducible Factor-1–Kv Channel Pathway Disrupts Oxygen Sensing and…Circulation, 2006, 113, 2630-2641Novel Role for Mitochondria: Protein Kinase C theta Dependent Oxidative Signalling Organelles in Acti…Molecular and Cellular Biology, 2007, 3625–3639
