多克隆 AffiniPure-VHH™ 二抗放大细节

用于高分辨率免疫染色的新型 VHH 片段抗体

了解更多Whole IgG Affinity-Purified Secondary Antibodies

\"我使用了多种二抗，Jackson ImmunoResearch 一直是最好的。荧光团明亮且稳定，其选择性（x 反应性已去除) 二级标记总是在多重标记中显示出物种特异性。”

Janet Duerr，俄亥俄大学

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免疫组织化学（IHC）二抗首页/技术中心/产品选择与使用/应用/免疫组织化学-免疫荧光技术服务：tech@jacksonimmuno.comImmunostaining with JIR Secondary AntibodiesOverview

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免疫染色原理组织或样本特异性一抗选择IHC选择用于 IHC 和 IFCell 的二抗以及使用 JIR 二抗进行组织染色

培养的淋巴管内皮细胞。细胞间粘附蛋白染成红色（使用 VEcadherin），F-肌动蛋白染成青色（鬼笔环肽）。细胞核是黄色的（用 DAPI 复染）。 Jackson ImmunoResearch 产品：Cy™3 AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)（最小 X）(705-165-147)。图片来源：Derek Sung

图 1：三重免疫荧光重新发生。使用 Cy™5 链霉抗生物素蛋白（蓝色 016-170-084）、GIP 通过 Cy™2 AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)（绿色 705-225-147）、微管蛋白通过 Cy™ 检测空肠绒毛中的 Ulex - 生物素3 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)（红色 715-165-150）。图片由明尼苏达大学的 Brian McAdams 和 William Kennedy 友情提供。

免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光免疫染色是强大的技术，在研究和临床诊断中不可或缺。它们是病理学实验室用于疾病诊断和分类的主要工具。在研究中，免疫染色技术用于研究许多生物过程，包括蛋白质表达模式的可视化、蛋白质相互作用的表征和组织边界的识别。因此，研究人员可以在细胞结构的背景下观察特定结构的分布和定位。

多标记指导浏览二抗

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免疫原理染色

组织分析物被一抗特异性识别，可直接偶联（直接免疫染色）；或者初级抗体本身可以通过偶联的二级抗体（间接免疫染色）进行检测，从而使分析物可视化。偶联抗体可以用多种报告分子中的任何一种进行标记，包括酶、荧光团和胶体金。多种分析物的表达可以通过多种标记方案中的单个一抗/二抗对进行观察和表征。

直接或间接免疫染色

可以在组织表面检测目标分析物或通过透化作用在内部进行检测样品的。分析物（抗原）可以直接检测（图 2 A），或使用与二抗偶联的荧光（免疫荧光）或报告酶（比色）探针间接检测（图 2 B）。

图 2：A 直接免疫染色，B 间接免疫染色，C 使用生物素化二抗和标记的链霉亲和素增强信号

使用二抗的间接方法具有许多优点。它通过与二抗偶联来保留一抗上的抗原结合位点。由于二抗可与多种荧光团偶联，因此间接方法增强了多重标记的可能性。此外，它提供了固有的信号增强，从而使多重二抗与一种抗原结合的一抗结合。通过使用生物素化二抗然后结合链霉亲和素（图 2 C）或使用过氧化物酶-抗过氧化物酶 (PAP) 方法可以进一步增强信号。

设计间接免疫染色方案

有助于实验成功的因素是感兴趣的组织，prima抗体选择、二抗特异性和信号检测选项。适当的封闭可确保最佳信噪比，而对照蛋白有助于解释结果。

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组织或样本特异性组织物种

实验样本的来源（物种）将影响实验样本的选择抗体。某些组织类型含有内源性免疫球蛋白 (Ig)，而其他组织类型则表现出血管系统，其中残余血液可提供内源性 Ig。对于间接免疫染色，二抗必须识别特异性一抗而不是内源性 Ig。使用与感兴趣的组织不同的宿主动物衍生的一抗最方便：在这种情况下，选择已交叉吸附（最小 X）的二抗，以尽量减少对内源性 Ig 的识别。如果实验策略包括使用来自与感兴趣组织相同宿主物种的一抗，则可以通过阻断 wi 来掩盖内源性 Ig二抗的单价 Fab 片段。也可以在与样品孵育之前用 Fab 片段标记一抗。

阅读有关 Fab 片段二抗的更多信息。

固定

组织固定是稳定和保存的过程处于接近其自然状态的配置的标本。由于化学固定改变了先天性水环境，因此可以修改抗原位点，使其无法被检测其天然状态的一抗识别。许多一抗在市场上标榜为\"经过验证”，可以在特定的固定条件下发挥作用，但可能无法获得此信息。在某些情况下，抗原修复方案可以将抗原位点恢复到其天然状态。

请注意，经验证可在免疫染色中发挥作用的抗体的概念对于一抗而言是独一无二的。如果一抗与其靶位点结合，则标记的二抗将与其结合组织固定。

内在信号

组织样本可能会揭示几种类型的内在信号。自发荧光（在没有荧光探针分子的情况下的信号）在光谱的某些区域可能很明显。在规划免疫荧光协议时，使用可用的过滤器组观察未标记的组织样本。选择与自发荧光有限的光谱区域兼容的荧光团。可以使用各种试剂抑制自发荧光，但这些处理的效率因组织类型和固定方法而异。

固有信号也可能来自内源性酶和/或生物素。要测试和控制这些类型的背景信号，请参阅我们的封闭和对照指南。

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免疫染色靶标的一抗选择

一抗应在预期的实验条件下识别感兴趣的蛋白质。一些一抗已经过验证，可根据规范使用ific条件，例如固定方法。仅针对蛋白质印迹验证的抗体可能不适用于免疫染色。

单克隆或多克隆

多克隆抗体可识别多个表位，最大限度地提高抗体检测抗原的机会，但可能会导致检测到同源蛋白并导致背景信号。单克隆抗体由单一细胞系产生的相同免疫球蛋白分子组成，适用于表位特异性检测需求。但是，它们可能会发出比多克隆抗体更弱的信号。对照可用于帮助确定抗体对每个检测系统的适用性。

一抗的宿主物种

理想情况下，一抗的宿主物种应与样本物种不同，以避免交叉-与内源性蛋白质的反应性。如果一抗和感兴趣的组织是同一物种，可以使用封闭方案来 pr事件脱靶信号。

检测多个目标

多重标记用于在同一测定中检测不止一种分析物。来自不同物种的一抗，或不同亚类的小鼠单克隆抗体，是多重标记的最佳选择。如果这些选择不可用，可以通过特殊策略实现多重标记。

阅读有关多重标记的更多信息抗体优化

对于一个实验方案，一抗可以令人满意地检测目标蛋白，但在不同条件下效果不佳。每次实验条件改变时，例如，当组织类型改变或使用不同的二抗检测系统时，优化并因此验证抗体是一种很好的做法。

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选择二抗用于 IHC 和 IF

为 IHC 和多重标记实验选择二抗时，请考虑下表中的标准e.

标记为\"ML”（多重标记）的亲和纯化抗体已专门制备以满足这些标准。

注意：通过仅在 PBS/Tween（不含载体蛋白，如正常血清）中稀释抗体，避免可能形成免疫复合物。为了限制不需要的相互作用，请按顺序孵育试剂，而不是混合多种抗体。

要求抗体示例二抗不得识别内源性组织免疫球蛋白。选择与感兴趣物种交叉吸附的二抗。在大鼠组织中，选择山羊抗小鼠 IgG (H+L)(min X Hu, Bov, Hrs , Rb, Rat Sr Prot)为了在同一物种的组织上可视化一抗（例如小鼠标记小鼠），用 Fab 片段阻断内源性 Ig。参见 Fab 片段阻断方案。二抗不得与内源性 Fc 受体和蛋白质结合.用与二抗相同物种的正常血清封闭。参见正常血清。多个二抗不得相互识别。如果可能，请使用源自同一宿主物种的二抗。驴抗小鼠驴抗兔驴抗豚鼠每个二抗只能识别其目标一抗。对于多种标记方案，选择二抗已与实验中使用的其他物种发生交叉吸附。驴中产生的抗体已与其他物种发生高度交叉吸附。要标记不同的小鼠亚类，请使用亚类特异性抗体。山羊抗小鼠 IgG1、IgG2a 等。参见抗小鼠 IgG 亚类特异性抗体。如果没有合适的交叉吸附抗体，请使用 Fab 方案进行多重标记。参见 Fab 片段阻断方案。检测

分析物可以在荧光显微镜下使用荧光偶联物观察，或在使用酶结合物和显色底物（比色检测）的光学显微镜n).使用胶体金抗体的银增强也可以通过光学显微镜进行检测。

每种检测方法都可以在灵敏度、定量、每次检测成本或检测多种分析物的能力方面提供优势。下表 1 比较了两种检测方法。

比色检测碱性磷酸酶 (AP) 和辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联物​​可用于比色检测。比色检测可以提供快速和容易获得的结果，具有出色的检测灵敏度。通过在连续孵育中使用不同的显色剂，可以实现多种分析物检测。

阅读有关报告酶的更多信息。

用 Cy™3-AffiniPure Go 染色的新生大鼠心肌细胞的原代培养在抗小鼠 IgG (H+L) (115-165-146) 和 Cy™2-AffiniPure 山羊抗兔 IgG (H+L) (111-225-144) 二抗以及 DAPI 复染液中。图片由 KCL 的 Elisabeth Ehler 提供。荧光检测

免疫荧光使用荧光染料偶联物来观察抗原。荧光 IHC 允许检测多种分析物，并且使用适当的荧光染料和滤光片组可以进行多达 5 种颜色的免疫荧光。剥离并与额外的抗体重新孵育导致在单个组织样本上探测到 20 种分析物。

阅读有关荧光探针的更多信息。

表 1：可以使用比色法或荧光检测法进行免疫染色。对用户的比较优势包括使用简单到同时检测多种抗原。ColorimetricFluorescentSensitivityHRP 偶联物比荧光偶联物更灵敏。Alexa Fluors® 和花青染料等荧光团更亮、更具荧光性比 FITC 更稳定，提高了它们的灵敏度。具有银增强功能的 ImmunoGold 也非常灵敏。价格昂贵且易于使用 简单的光学显微镜很常见。落射荧光显微镜很容易获得且用途广泛。昂贵的多通道显微镜可能需要使用核心设施，增加实验成本和难度。分辨率细节和询问深度受样品质量和厚度的限制。使用共聚焦显微镜可以检测到最大细节，包括使用扫描激光编译 3D 图像在更厚的样品切片中可视化的技术。使用 ImmunoGold 试剂的电子显微镜提供出色的分辨率。超分辨率显微镜允许将图像分辨率降至 50 nm。多路复用（同时检测多种抗原）可以通过使用不同的显色剂标记多种分析物在连续孵育中检测。可以使用适当的 micr 进行多达 5 种颜色的免疫荧光示波器激光器和过滤器设置。已报告使用多轮剥离和再孵育进行额外的多路复用。共定位分析物可以按通道识别，并且它们的信号合并以按颜色识别重叠。颜色稳定性污渍稳定并且在显微镜下检查期间不会褪色。载玻片可以保存多年。荧光结合物的光稳定性可能不同，这使得数据收集时间敏感。永久封固剂可以延长存档幻灯片的寿命。先进的技术荧光染料可用于多种技术来表征生物相互作用。 FRET（Förster 共振能量转移）可用于检查结构特征、结合化学计量和亲和力。超分辨率显微镜可将图像分辨率降至 50 nm。荧光试剂使实时观察活细胞成为可能。IHC 可以使用比色和荧光检测进行。A：使用 DAB 进行比色检测。B：HEP2 细胞中的双重免疫荧光。使用 Brilliant Violet™ 421 和 480 染色，使用 DRAQ5™ 进行核染色。封闭试剂

封闭这些步骤可以显着改善结果并简化免疫染色实验的分析。为避免来自非特异性、保守序列和/或 Fc 受体结合的意外信号，我们建议使用标记抗体宿主物种的正常血清进行封闭（5% v/ v). 其他封闭试剂，如 BSA 或市售封闭剂，也可能有效降低背景。

控制

添加实验控制将改进结果分析并有助于故障排除。

阅读有关封闭和对照的更多信息。

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使用 JIR 二抗进行细胞和组织染色

免疫组化 (IHC) 等免疫染色技术的建议稀释范围), 免疫细胞化学 (ICC), 和免疫荧光 (IF) 如下表所示。

ProductConjugateHisto-/Cyto chemistryWhole IgG and F(ab\')2 secondary antibodiesUnconjugated10-20 µg/mlFab secondary antibodiesUnconjugated20-40 µg/mlWhole IgG、F(ab\')2 和 Fab 片段二抗Alexa Fluor® 488、594、647、DyLight™ 405 和 Cy™31:100-1:800 全 IgG、F(ab\')2 和 Fab 片段二抗 AMCA、BV421 ™、BV480™、Cy2、FITC、TRITC、RRX 和 Texas Red1:50-1:200 全 IgG 二抗Cy™51:100-1:400全 IgG 和 F(ab\')2 二抗辣根过氧化物酶 1:500-1:5,000全 IgG、F(ab\')2 和 Fab 二抗生物素-SP（使用荧光团偶联的链霉亲和素）1:200-1:1,000全 IgG 和 F(ab\')2 二抗生物素-SP（使用酶偶联的链霉亲和素）1 :500-1:5,000StreptavidinHorseradish Peroxidase1-2 µg/mlStreptavidinAlkaline Phosphatase1-2 µg/mlStreptavidinAlexa Fluors®, DyLight 405, and Cy30.5-2 µg/mlStreptavidinCy50.5-2 µg/mlStreptavidinAll 其他荧光团2-5 µg/ml4 nm 金抗体复合物1:20-1:2006, 12 nm 金抗体复合物1:20-1:4018 nm 金抗体复合物1:10-1:20过氧化物酶-抗过氧化物酶 (PAP) 25-50 µg/mlFabuLight™ 抗 IgMAll 荧光团要与溶液中的一抗复合，请使用重量比为 1:1 的 Fab：一抗（15:1 摩尔比）。FabuLight 抗 IgGAll 荧光团要与溶液中的一抗复合，请使用Fab：一抗的重量比为 1:1（摩尔比为 3:1）。用于阻断的正常血清 5% (v/v)ChromPure™10 µg/ml Top ×

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