通过乙肝病毒大表面蛋白诱导的细胞液泡化和细胞凋亡
纤维淤胆性肝炎(FCH)是乙肝病毒的一种快速发展的过程，它发生于严重的免疫抑制病人中。病理学方面，FCH状态下的肝脏的主要特征是肝细胞产生广泛性的液泡化和细胞凋亡，相比较于普通的乙肝的形成，它很少产生明显的炎症反应。因此，对于FCH，已经被提出，肝细胞的损伤更多的是来自于病毒性的细胞病变效应，而非来自于宿主的免疫反应。作为以上猜想的证明，我们提供了证实，即在培养的肝细胞中转染进选择性表达病毒大的表面蛋白的质粒，从而形成许多大的液泡和产生细胞凋亡。体内的FCH细胞病理情况和体外的这些转染细胞的病变的相似性，表明大的表面蛋白是形成这种急性肝病的直接原因。已发表的关于在FCH下肝细胞中积累大的表面蛋白，这种蛋白是通过病毒而超量表达的，它支持了以上的结论。总之，我们的数据表明在纤维淤胆性肝炎中，大的表面蛋白是导致肝细胞损伤的主要原因。
前言：乙肝病毒（HBV）为包膜DNA病毒，它在世界范围内广泛发生[1]。大多数的感染病人能够产生有效的免疫反应并清除病毒。然而，少数个体不能够如此，并且形成了慢性感染。他们会发展为慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。每年有超过1百万的人死于慢性乙肝感染的并发症。
通常我们认为，乙肝相关的肝损伤不是由病毒自身引起，而是通过宿主的免疫反应[2，3]。这种论断由许多发现所支持，这其中包括当在慢性感染个体的百分比例中缺少临床的和病理学上的证据，那些个体仍然在他们的肝细胞中表现出高水平的病毒复制[1]。进一步的，在培养基中生长的肝细胞，转染进乙肝基因组，它可以产生不定数的病毒颗粒，没有证据表明对于它们的复制有细胞病变或者其它负作用[4]。然而，这种病理机制不是对于所的乙肝病例都起作用。在特殊情况中，严重的免疫抑制病人可能死于乙肝感染的情况，如纤维淤胆性肝炎（FCH）。当在FCH情况下，在肝细胞中积累大量的病毒蛋白，伴有广泛的肝细胞液泡化和细胞凋亡，在临床上，产生快速的肝纤维化和肝功能衰竭[5-9]。由于在这些患者中缺少明显的肝炎炎症和免疫抑制，表明了在这些疾病中，一种或多种病毒基因产物和肝细胞的损伤有着一定的联系。乙肝产生的大的表面蛋白有可能是以上现象的起因，因为在转基因小鼠的肝脏中过量表达大的乙肝表面蛋白，表现出慢性的肝炎症状，尽管还没有直接的证据证实对于大的表面蛋白造成的急性细胞病变。
在此次研究中，我们提供了实验证据，表明了在培养的肝细胞中表达乙肝的大的表面蛋白会引起细胞凋亡。在死亡之前，来自于粗糙内质网（ER）的小泡，通过膨胀的膜介面的积累，致使细胞表现出明显的细胞质液泡化作用。FCH的肝脏病变，在体外有着相似的反应，和先前的FCH下肝细胞细胞质中大的病毒表面蛋白的情况积累，表明了大的表面蛋白在此种疾病的病理中有着重要的作用。
材料和方法：
质粒，pCMVβ（Clontech, PaloAlto, CA）质粒使用的是巨细胞病毒（CMV）即早期启动子来表达半乳糖苷酶。质粒pCMV-EGFP，表达绿色荧光蛋白，它的构建带有CMV启动子，用EcoRI和SmaI消化pCMVβ，再连入用EcoRI和SmaI消化的pEGFP-1（Clontech）。质粒pSFFV-Bcl2和pSFFV-Bax表达Bcl2和Bax。质粒pSV2neo表达新霉素抑制基因，此质粒来自于J.Ou。质粒pCMVLM-S-，表达乙肝大的表面蛋白，由CMV即早期启动子控制，表达的乙肝X蛋白，由其自身启动子控制，如先前的描述[13]。质粒pCMVLM-S-X-和质粒pCMVLM-S-相似，只是它的X基因104密码子进行了突变，由TCA变为TAG。这个突变阻止了任何有功能的X蛋白的产生。
细胞培养和DNA转染。HuH-7和NIH3T3细胞用Dulbecco的改进的Eagle培养基培养，其中加有10%的胎牛血清，在37℃下，93%的空气和7%的CO2的条件下进行。细胞在60mm的培养瓶中，磷酸盐的条件下转染，如前所描述，或者用FuGene6。对于FuGene6介导的转染，5μg的质粒DNA和15μL FuGene6及200μl无血清培养基一起在室温下预培养20分钟。混合物再加入到60-mm培养瓶，并加入5mL含血清的培养基。过夜培养后，用新鲜的培养基来更换。在一些实验中，细胞在开始转染后的24或48小时开始收集。另一些实验中，每两天，转染的细胞在加入新鲜的培养基之前用PBS冲洗两次，直到转染3或6天后细胞被收集。斑点计数，用10μg的pSV2neo和10μg的pCMVB， pCMVL+M-S-及pCMVS转染Huh-7细胞。转染后的Huh-7细胞用胰蛋白酶消化48小时，再转入100-mm培养皿，加入10mL培养基和500μg的geneticin。抗药性的克隆经过3个星期在这些培养皿中形成，在它们形成之前用Giemsa染料显色。直径大于2mm的可见斑被计数统计。
通过荧光活化细胞分选仪检测DNA的量。参考Juan和Darzynkiewicz手册[15]。简述之，转染后6天，收集培养基，通过胰酶消化收集细胞。混合的培养基和细胞在300g，4℃下离心5分钟，之后重悬到0.5mL Ducbecco的PBS缓冲液中。细胞滴加入14mL的冰乙醇并于-20℃条件下过夜。乙醇混合的细胞在300g，室温条件下离心5分钟，用5ml的PBS冲洗，再次离心。细胞重悬于0.5ml的透化溶液（0.25% Triton x-100于PBS中），并在室温下放置5分钟。透化后的细胞再次离心，重悬于200μl的冲洗液（含1%的牛血清蛋白的PBS），含有恰当的稀释的初级抗体，在室温下培育60分钟，并不时地轻轻摇动。培育后，在离心之前用5ml的冲洗液处理细胞，重悬于200μl的冲洗液中，加入稀释的荧光标记的二抗，稀释度为1：40（Sigma Chemical CO.,St.Louis, Mo），在室温下培育45分钟。加入5ml的冲洗液并离心，细胞重悬于1ml的PBS，其中含有100μg的无脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶A，和5μg的碘化丙啶。细胞在暗处室温下培养1小时，用35μm的细胞滤网膜过滤（Falcon,Lexington, KY），并且用荧光活化细胞分选仪分析。FACS Calibur的起始点设立在碘化丙啶正值处，不包括小的碎片和大的双联体或团块。每个样品中至少有100，000个细胞用ModFit LT来分析，此细胞循环分析软件来自于Verity, Inc., Topsham, ME。
初始抗体使用的是多克隆兔抗β-半乳糖苷酶抗体，稀释度为1：250（5 Prime→3 Prime Inc, Boulder, co），或者使用单克隆鼠HBV表面蛋白抗体，稀释度为1：50（DAKO，Carpenteria, CA）。
Western Blotting。用5μg的pCMVL+M-S-X-或pSFFV Bax转染Huh-7细胞，第3天时，细菌生物碱加到一些培养瓶中，终浓度为2μmol/L。第4天，收集细胞，用胰蛋白酶处理，胞融物中加入提供的caspase－3抗体。细胞用PBS冲洗一次，再用5倍于细胞体积的溶解缓冲液重悬，细胞反复冻融3次，经过14,000g离心10min，收集上清于小离心管中。取1/4体积的上清液，和等体积的2xtricine凝胶上样缓冲液混合（Novex, Carlsbad, CA），煮沸5min，然后在tricine缓冲液中进行10%到20%的丙烯酰胺梯度电泳。凝胶中的蛋白转移到Immobilon-P膜上（Millipore, Bedford, MA），用兔抗caspase3 的多克隆抗体标记，在PBS溶液中，按1：1,000稀释，Tween20的体积比为0.05%，并含有质量百分比为5%的脱脂奶粉。结合抗体通过加强的化学发光反应物来检测（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）。
转染细胞的形态分析。为了证实凋亡，用1μg的pCMVEGFP和10μg的pCMVL+M-S-X及pCMVβ共转染HuH-7细胞。转染后3天，收集培养基，加入Hoechst 33342到终浓度为20μg/mL。混合物置于冰上30分钟，加入终浓度为1%（wt/vol）的三聚甲醛。在冰上培育90分钟后，使用ThinPrep 2000使细胞单层覆盖于玻片上。第二个检测，盲传样品进行检验，用荧光显微镜进行分析。至少150个GFP阳性细胞出现了细胞核构型上的压缩或片段化，这是细胞凋亡的特征。
为了检测转染细胞的组织学特征，HuH-7细胞生长在LabTek chamber玻片上（Nalge Nune, Rochester, NY），用pCMVL+M-S-X或pCMVS来转染此细胞。转染后两天，细胞中混入4%的中性甲醛缓冲液，并且在UCSF，免疫组化病理学系，用曙红Y对表面蛋白进行染色，使用1：10稀释的鼠多克隆抗体（Zymed），北San Francisco, CA, 并且使用Ventana（Tucson, A2）的自动染料。来自于FCH症状的病人的肝组织也用类似的方法进行染色来检测表面蛋白。
电镜观察，HuH-7细胞在转染后的1或2天，加入中性的磷酸缓冲液固定，其中含有2%的戊二醛，之后加入四氧化锇，并包理进Epon中。切成80nm的部分，使用柠檬铅和醋酸铀染色，使用Philips (Hiusboro, OR)CM10电子显微镜观察。
结果：大的表面蛋白的表达缺少稳定性。乙肝表面基因编码3种表面蛋白（包膜蛋白），称为大的，中的和小的（主要的）表面蛋白[3]。它们起始于不同的同框ATG启始密码子处，但终止于相同的终止密码子处。由于不同的转录和转录后的调节，通过感染的肝细胞合成的大的表面蛋白远远少于中等的和小的表面蛋白[16]。实际上，之后形成的蛋白在数量上远远超过病毒形态发生所需的量。作为一种结果，大量由中等和小的表面蛋白所组成的没有感染性的亚病毒颗粒分泌到感染的肝细胞血清中。相对应的，如果大的表面蛋白超量表达（或通过自身表达），亚细胞颗粒将不会分泌，而是积累在内质网一高尔基体的中间组成过程中（ERGIC）[17-21]。
