在缓冲液中进行蛋白质提取，该缓冲液由以下成分组成：Tris 10mM、EDTA1mM、蛋白酶抑制剂 pH 7.4（例如德国 Quartett 的蛋白酶抑制剂试剂盒或 Roche-Sigma 的 cOmplete（目录号 04693159001 Roche）。
在上述缓冲液中通过超声处理（2 x冰上 10 秒，然后在 4°C 下以 14’000 rpm 离心 10 分钟）。
上样30 至 50 ug 蛋白质/泳道
对照：小脑或肌肉（EDL：趾长伸肌）
SDS 凝胶：12 或 15% SDS 聚丙烯酰胺凝胶
蛋白质转移S半干 1 小时，60mA/膜。
转移缓冲液：Tris Base 25mM，甘氨酸 192mM (pH8.3) 200 ml 甲醇 1L。
一抗和二抗：一抗在 2% 牛奶/TBST 中按 1:2\'000 至 1:10\'000 稀释，4°C 过夜。
二抗抗体（例如兔）Sigma A0545，稀释1:10’000，室温2小时，2&a议员；牛奶/TBST
检测系统Luminata forte (Millipore) 或Advansta 的WesternBright Quantum
对于使用自动相机拍照很重要：如果您在较高分子量中有很强的条带，请用一张黑纸将其隐藏并重复检测，乍一看您没有条带（例如12 KDa）。
使用豚鼠抗血清对切片进行免疫标记的程序材料自由浮动低温恒温器或振动切片（用 0.1 M 磷酸盐缓冲液中的 4% 多聚甲醛固定，pH 7.4）或用 Bouin 液或 10% 福尔马林固定的组织石蜡切片。0.1M Tris 缓冲盐水 (TBS) pH 7.3。SWant 豚鼠抗血清。生物素化抗豚鼠猪 IgG。亲和素-过氧化物酶（或链霉亲和素-荧光染料 [例如 Cy2 或 Alexa 488]）过氧化物酶底物（例如用于免疫过氧化物酶的二氨基联苯胺-HCl 和 H2O2。乙醇和二甲苯（仅用于免疫过氧化物酶）。用于免疫过氧化物酶的封固剂 [Pertex，Histolab]），[Hydromount，National Diagnostic]（用于免疫荧光）。方法应用 SWant 抗血清按 1:1\'000-1:5\'000（石蜡切片）或 1:5\'000-1:10\'000（浮动切片）在含有 10% 载体血清（例如小牛或马血清）和 0.1-0.2% Triton-X 100 的 TBS 中稀释。在 4°C 下孵育 1 至 3 天（对于自由浮动切片，在摇床上，在 4 ℃ 的潮湿室中） °C 对位ffin 切片）。在 TBS 中冲洗 3 x 5 分钟。将生物素化抗豚鼠 IgG（根据供应商的建议稀释）涂在含有 10% 载体血清的 TBS 中。在室温 (RT) 下孵育 2 至 4 小时。在 TBS 中冲洗 3 x 5 分钟。将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（根据供应商的建议稀释）或链霉亲和素-荧光团（例如 Cy2 或 Alexa 488）涂在含有 10% 载体血清的 TBS 中。在室温下孵育 1 至 2 小时。在 TBS 中冲洗 3 x 5 分钟。对于免疫过氧化物酶：用过氧化物酶底物（例如二氨基联苯胺-HCl / H2O2）处理切片。在 TBS 中冲洗 3 x 5 分钟。将自由浮动切片安装在载玻片上，最终用甲酚紫复染。对于免疫过氧化物酶染色，用乙醇和二甲苯脱水，然后在 Entellan 中封片和盖玻片。用于 Hydromount 中的免疫荧光染色封片和盖玻片。注意：如果背景染色过度，请使用更高稀释度的 SWant 抗体。
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