获得更好的 ELISA 结果的技术提示
ELISA 简介
ELISA 样品
ELISA 封闭和洗涤步骤
如何优化您的 ELISA 实验
常见 ELISA 问题
ELISA 简介酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是最灵敏和可重现的可用技术之一。这些测定快速、易于执行且易于自动化。与任何检测一样,ELISA 的重现性和可靠性取决于适当的技术和对细节的关注。
ELISA 技术分为:
直接 ELISA,其中抗原固定在ELISA板,一抗带有标记(图1A)
间接ELISA,抗原固定在ELISA板上,二抗带有标记(图1B)
间接ELISA,抗原固定在ELISA板上,二抗带有标记(图1B)
夹心 ELISA,其中两个主要抗体(用于捕获和检测)嵌入抗原,形成\"三明治”,然后复合物被标记的二级抗体识别(图 1 C)。
图 1. ELISA 形式的类型:A) 直接、B) 间接和 C) 夹心 ELISA。
ELISA 试剂盒中的匹配抗体对匹配对是指已知可识别不同抗体的抗体组同一蛋白质抗原上的表位,因此它们可以一起用于夹心 ELISA 中单个抗原的捕获和检测。 ELISA 检测中使用的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或两者的组合。
单克隆抗体可用于所有类型的 ELISA 中所有包含抗体的步骤。它们通常成套使用,作为夹心 ELISA 中的匹配对,但可用于捕获或检测与多克隆抗体结合以增强信号或提供更大的机会从复杂溶液中捕获抗原。
由于多克隆抗体溶液中抗体的异质性和表位的广泛代表性,多克隆抗体抗体是检测抗原的有力工具,通常产生比单克隆抗体更高的信号水平。然而,多克隆抗体更有可能与密切相关的蛋白质共享一个或多个表位,从而导致更高的非特异性信号。减少这个问题的一种方法是使用亲和纯化或交叉吸附的多克隆抗体。为了提高检测灵敏度,ELISA 的检测方法可以从使用多克隆抗体的直接检测转换为间接检测。
ELISA 样品ELISA 可以检测多种样品,检测条件的选择将取决于样品的复杂性和抗原存在的预期量nt.
重要的是要结合已知标准对所有样品进行一式两份或一式三份测试,以确保结果和定量的准确性。
最好测试几个稀释度一个样品,以确保最终结果落在标准曲线的线性部分内。高度浓缩的样品可能会低估浓度,而高度稀释的样品可能会高估浓度。
ELISA 封闭和洗涤步骤通常需要封闭以防止检测抗体与多孔板表面本身发生非特异性结合。当板完全封闭时,由于非特异性信号会减少,因此检测灵敏度会提高。
彻底的清洗程序对于获得可靠的 ELISA 结果至关重要。通过轻轻地将吸头降低到底部,从所有孔中完全吸出液体非常重要。避免划伤井的内部。洗涤完成后,建议倒置将其放在吸水纸巾上擦干。
如何优化您的 ELISA 实验虽然每个组分都是单独描述的,但在许多情况下,可以通过执行棋盘滴定同时优化两个组分。
1) 捕获抗体浓度
在包被缓冲液中制备不同浓度的捕获抗体。2) 封闭缓冲液
制备不同的封闭液。如果封闭溶液未预先配制(即,它是单一蛋白质,例如 BSA),请尝试不同浓度的蛋白质。3) 标准稀释剂
尝试将标准稀释剂匹配为
如果不能精确复制基质本身,则测试不同的标准稀释溶液并检查样品的标准曲线和稀释线性。可能需要选择不同的稀释剂。
如果样品的线性度差,样品之间可能存在不平衡le 矩阵和标准稀释剂。在这种情况下,应进行加标回收或稀释线性实验。4) 样品浓度
准备不同浓度的样品,同时牢记底物的检测限。为确认生物样品基质未掩蔽或增强信号,应进行加标回收和线性稀释实验。5) 检测抗体浓度
制备不同浓度的检测抗体.6) 酶联物浓度
根据描述的底物ELISA试剂盒范围制备不同浓度的酶联物。7) 信号检测
选择底物(s) ) 根据样品中抗原的量和用酶标仪检测的能力。
如果能清楚地检测到抗原,则底物是合适的。
如果抗原低于检测阈值,然后选择
常见的 ELISA 问题1) ELISA 信号弱或无信号
建议在开始测定前将所有试剂在室温下放置 15-20 分钟。
组件存储不正确。仔细检查试剂盒标签上的储存条件。大多数试剂盒需要在 2–8oC 下保存。
试剂添加/制备不正确。检查协议,确保按正确顺序添加试剂,并准备正确稀释。
荧光试剂过度曝光。强光可通过荧光团的分解引起光漂白。保护荧光团免受光照对于在分析结束时产生有效信号至关重要。
组件需要进一步优化。测定的其中一种成分可能处于极限浓度,导致整体信号较低。
试剂降解。其中一种试剂可能已经降解或被污染,在这种情况下应该更换它。
抗体是一对低效的配对或对目标缺乏足够的亲和力。使用的抗体可能无法有效结合抗原,或者可能无法相互结合使用。在这种情况下,必须测试替代抗体。
检测系统需要进一步优化。检测系统(底物)可能不够灵敏,无法发出信号,或者标准曲线可能不适合样品。可能需要浓缩样品或切换到更敏感的底物。
2) 高背景
洗涤或封闭不充分。高背景信号通常是洗涤或封闭不充分、样品成分或抗体与封闭缓冲液发生交叉反应,或者使用过多酶偶联物的结果。
平衡给出特定信号的酶与给出背景信号的酶。控制这种情况的最有效方法是优化酶偶联物、抗体、d 封闭溶液。
3) 标准曲线线性度差
如果标准曲线线性度差,则样品必须落在严格的浓度范围内才能被视为准确。
如果曲线具有良好的线性但重复之间的变异性差(即标准误差),则可能存在技术问题,例如样品或个别用户之间的移液不一致。
所有样品和标准品都应至少测量一式两份或一式三份以缓解此问题。
4) ELISA 中的信号过高
洗涤不充分。为避免此问题,请使用适当的清洗程序,例如,在每个清洗步骤结束时,将板倒置在吸水纸巾上,让其完全沥干,必要时用力敲打以去除任何残留的液体。
孵育时间过长。孵育时间过长也是ELISA信号过高的一个原因;一定要遵循推荐的孵育时间。
污染。避免使用印版封口机是个问题,每次打开印版时都使用新的封口机。这将防止孔相互污染。

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