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一本为您的科学应用选择正确的偶联二抗的有用指南。
二抗可与许多标记物偶联,包括酶、生物素和荧光染料/蛋白。标记物的选择主要取决于所进行的实验应用。
免疫检测实验
二抗标记物
酶(通常是 HRP 或 AP)、生物素
免疫荧光
荧光标记物、生物素
免疫组织化学
酶、生物素
流式细胞术
荧光标记物、生物素
免疫细胞化学
荧光标记物、生物素
酶 - 是蛋白,它们作用的分子称为底物。酶标记物可在酶组化方法中通过显色反应(即可溶性无色底物转化为不溶于水的有色化合物)显色来达到可视化。
最常用的两种酶是:
辣根过氧化物酶 (HRP) -可通过显色反应,例如二氨基联苯胺 (DAB))或化学发光达到可视化。HRP 是 44 kDa 的糖蛋白酶标记物,比碱性磷酸酶更稳定。
HRP 标记的二抗
碱性磷酸酶 (AP) -是水解酶,我们通常可通过比色底物 pNNP 测量 AP 的信号。
AP 标记的二抗
生物素/链霉亲和素 - 当靶标的表达水平太低,不能仅靠二抗标记的抗体检测时,通常使用生物素/链霉亲和素。许多生物素分子可偶联至二抗,而链霉亲和素对生物素的高亲和性提供了额外的优势。通过这一放大步骤,并且通过将链霉亲和素结合于标记物(例如 HRP 或荧光探针),低表达水平的蛋白可更容易被检测。在检测中,研究人员通常先加入生物素标记的二抗,然后加入链霉亲和素偶联的标记物(例如 HRP)。
生物素标记的二抗.
荧光偶联二抗- 对于多色分析,科学家倾向于使用与荧光标记物偶联的二抗。由于其独特的电子构型,这些荧光标记物具有特征性吸收和发射光谱,即单个染料在特定波长被激发,并在另一波长发射光子。此外,串联染料则由供体和受体荧光素分子组成,两种分子的位置非常靠近,使二者之间可发生能量转移。串联染料在供体分子的激发波长处被激发,并以受体分子的发射波长发射光子。
需要特别提出的是,我们现在提供一系列 Alexa fluor® 偶联物,这类偶联物是多色分析的理想选择,覆盖从 UV 到远红外的整个光谱。不仅如此,我们还提供了多种物种的Alexa fluor® 染料偶联二抗,并且许多偶联二抗都已经经过预吸附处理,可确保低交叉反应性。
选择荧光偶联二抗的考虑事项
下表列出了我们提供的荧光标记二抗产品。为方便您查看,我们也提供最大吸收波长、最大发射波长和消光系数。
多色分析的荧光标记二抗的选择技巧:
· 选择适合您的仪器的最亮的荧光染料组合
· 荧光光谱的重叠度可以通过选择正确的荧光标记物尽可能减少
· 确保将最亮的标记物和表达水平最低的蛋白组合,反之亦然。
· 使用二抗时,检查并确保一抗来源于不同的物种,以避免二抗的交叉标记。注意,我们提供针对同一物种的不同亚型的二抗(小鼠 IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3 等),为您提供更多选择。当然,您必须使用相应亚型的一抗。
· 多色分析中通常使用预吸附的二抗,以确保不同物种之间的交叉反应最小。
· 有时候样品的自发荧光会产生问题,您在选择二抗偶联物时必须考虑这点。例如,肝切片在红色通道中发出自发荧光,因此,在对此类组织类进行染色时,应避免使用在红色通道中发光的标记物。
标记物
最大吸收波长 (nm)
最大发射波长 (nm)
消光系数
Alexa Fluor® 405
402
421
35,000
AMCA
346
442
19,000
Cy2
489
506
150,000
DyLight® 488
493
518
70,000
Alexa Fluor® 488
495
519
73,000
FITC
494
520
70,000
Alexa Fluor® 555
555
565
155,000
Cy3
550
570
150,000
PE
488
575
1,960,000
TRITC
557
576
100,000
DyLight® 550
562
576
150,000
Rhodamine
544
576
80,000
TAMRA
557
583
203,000
Cy3.5
576
589
150,000
Alexa Fluor® 568
578
603
88,000
PE/Texas Red®
535
615
-
Texas Red®
595
615
85,000
Alexa Fluor® 594
590
617
92,000
DyLight® 594
593
658
80,000
APC
650
662
700,000
Cy5
643
667
250,000
Alexa Fluor® 647
650
668
270,000
PE/Cy7
488
670
-
DyLight® 650
652
672
250,000
Cy5.5
675
694
190,000
PE/Cy5.5
535
694
-
Alexa Fluor® 680
679
702
183,000
Alexa Fluor® 750
749
775
290,000
APC/Cy7
633
776
-
Alexa Fluor® 790
784
814
260,000
Alexa Fluor® 和 Texas Red 是 Life Technologies 的注册商标。Alexa Fluor® 染料偶联物包含由 Life Technologies 授权给 Abcam 的技术。DyLight® 是 Thermo Fisher Scientific Inc 及其子公司的注册商标。