Goat Anti-Human Free erythrocyte proloporphyrin                                                                                                   Storage: 2 - 8 °C                                       Package size: 96 determinations    PRINCIPLE OF THE METHODThe FEP kit is a solid phase phase sandwich enzyme linked immuno sorbent assay(ELISA). Samples , including standards of  known FEP concentrations and unknowns are pipetted into these wells. During the first incubation, the FEP antigen and a biotinylated monoclonal antibody specific for FEP are simultaneously incubated. After washing, the enzyme(streptavidin-peroxydase)is added. After incubation and washing to remove all the unbound enzyme, a substrate solution which is acting on the bound enzyme is added to induce a coloured reaction product. The intensity of this coloured product is directly proportional to the concentration of FEP present in the samples. REAGENTS PROVIDED AND RECONSTTTUTIONREAGENTS（Store at 2-8℃）1×96 WELLS0.5×96 WELLSRECONSTTTUTION96/48-wells microtiter plates10.5Ready-to-usePlastiv cover21Ready-to-useStandard: 32umol/L1Vials  (0.6ml)0.5Vials  (0.3ml)See reagents preparation on page 3Blank control1Vials  (1.0ml)1Vials   (0.5ml)Ready-to-useStandard Diluent1Vials  (4.0ml)1Vials   (2..0ml)Ready-to-useBiotinylated anti-FEP1Vials  (6.0ml)1Vials   (3.0ml)Ready-to-useStreptavidin-HRP1Vials  (8.0ml)1Vials   (4.0ml)Ready-to-useWashing Buffer1Vials  (20ml)1Vials   (10ml)50× concentrateSubstrate  A1Vials  (6.0ml)1Vials   (3.0ml)Ready-to-useSubstrate  B1Vials （6.0ml)1Vials   (3.0ml)Ready-to-useStopping Solution1Vials  (6.0ml)1Vials   (3.0ml)Ready-to-useSample Diluent 1Vials  (12ml)1Vials   (6.0ml)Ready-to-use32 umol/L（6  Standard）Original density 50ul。16 umol/L（5  Standard）100ul  6 Standard  +100ul diludent8.0 umol/L（4  Standard）100ul  5 Standard  +100ul diludent4.0 umol/L（3  Standard）100ul  4 Standard  +100ul diludent2.0 umol/L（2  Standard）100ul  3 Standard  +100ul diludent1.0 umol/L（1  Standard）100ul  2 Standard  +100ul diludent0 umol/LBlank Control50ul。 

• Washing buffer 50×concentrate:  Dilute 50 times in distilled water.

 ASSAY METHOD

• Before use, mix all reagents thoroughly without making foam.
• Determine the number of microwell strips required to test the desired number of samples,plus appropriate number of wells needed for running blanks standards. Each sample, standard and blank should be assayed in duplicate. Remove sufficient microwell strips from the pouch.
• Add 50ul of standard diluent to standard wells B1,B2,  C1,C2,  D1,D2,  E1, E2,  F1,F2. Reconstitute standard vial with the appropriate volume as described in the chapter reagents preparation. Preparation. Pipet 100ul of standard into wells A1 and A2 (see plate scheme below). Transfer 50ul from A1 and A2 to B1 and B2 wells. Mix the contents by repeated aspirations and ejections. Take care not to scratch the inner surface of microwells. Repat this procedure from the wells B1,B2 to wells C1,C2 and from wells C1,C2 to D1,D2 and so on creating two parallel rows of FEP standard dilutions ranging，Add 50ul of standard diluent to the bland wells.
• Dilute samples 1:1 distribing 50ul of sample into 50ul of dilluent ,Add 50ul of diluted sample to wells..
• Add 50ul of diluted biotinylated anti-FEP to all wells.
• Cover with a plate vover and incubate for 1 hour at 37℃.
• Remove the cover and wash the plate as follows: ⑴　aspirate the liquid from each well, ⑵　dispensse 0.3ml of washing solution into each well. ⑶　Aspirate again the contet of each well after 0.5 minute. ⑷　Repeat steps ⑵ and ⑶ three times.
• Distribute 60ul of streptavidin-HRP solution to all wells, including blank wells.
• Cover and incubate 30 min at 37℃.
• Remove the cover and empty wells, Wash microwell strips according to step, Proceed immediately to the next step.
• Add 50ul Substrate A and Substrate B to each well。Incubate for 10 min at 37℃。
• The enzyme-substrate reaction is stopped by quickly pipetting 50ul of H2SO4. stop reagent into each well, including the blank wells, to completely and uniformly inactivate the enzyme. Results must be red immediately after the addition of H2SO4.
• Read absorbance of each well on a spectrophotometer using 450nm as the primary wavelength and optionally 620nm (610nm to 650nm is acceptable ) as the reference wavelength.

  SUGGESTED PLATE SCHEME Standardconcentrations（umol/L） A3232samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleB1616samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleC8.08.0samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleD4.04.0samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleE2.02.0samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleF1.01.0samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleG00samplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesampleHsamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesamplesample LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Do not extrapolate the standard curve beyond the max  standard curve point. The dose-response is non-linear in this region and good accruacy is difficult to obtain.  CALCULATION OF RESULTS The minimum detectable concentration in this assay is estimated to be 0.1umol/L