说到小麦病虫害，就不得不提小麦的白粉病。由Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)白粉菌引起的小麦白粉病是一种世界性的小麦病害，在主要麦产国都有发生。虽然人们在抗白粉病领域做了巨大工作，但是一些小麦品种的抗性由于一些新的致病小种的出现而丧失。因此人们试图从白粉菌侵染植物的分子机理出发，希望可以以此为切入点，培育出持久抗白粉病的小麦。植物先天免疫主要有两道防线，第一道防线即病原体相关分子特征（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）触发的免疫PTI（PAMP-triggered immunity），限制初始病原体入侵和复制，第二道防线即效应因子触发的免疫ETI（effector-triggered immunity），通过产生超敏反应达到免疫目的。PTI和ETI的激活造成大量的转录重编程，而这些重编程受到不同调控机制的严格调控，其中表观遗传的调控尤为瞩目。

DNA甲基化是一个重要的表观调控机制，不同于动物中甲基化主要发生在CpG岛，在植物中有CG、CHG、CHH三种不同的序列甲基化（H是除了G以外的核苷酸）。DNA的甲基化一方面可以导致基因沉默，另一方面可以通过沉默转位因子（transposable elements TEs）从而达到基因的完整。不同类型序列的DNA甲基化都是通过RdDM（small RNA-directed DNA methylation）途径来添加的。这个途径中，24nt的siRNA与AGO4结合，在RNA聚合酶V和甲基化酶DRM2的共同作用下完成DNA甲基化反应。三种不同的甲基化酶MET 1 、CMT2/3、DRM2分别负责CG、CHG、CHH的甲基化。在近期的植物免疫研究中，表观遗传的调控特别是DNA的甲基化在其中发挥了重要的作用。例如在拟南芥中，基因的高甲基化或者去甲基化突变，拟南芥对丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的抵抗增强。除此之外，水稻中，甲基化也调控着水稻稻瘟病的抗性。而对于小麦对白粉菌Bgt防御中的表观遗传调控研究较少。2018年9月6日，New Phytologist在线发表了中国农业科学院作物科学研究所毛龙研究员、李爱丽研究员与四川农业大学小麦研究所兰秀锦研究员为通讯作者的题为\"DNA methylation dynamics during the interaction of wheat progenitor Aegilops tauschii with the obligate biotrophic fungus Blumeria graminis f. sp. tritici”的研究论文。基因表达调控该论文从DNA甲基化层面对小麦的抗病机制进行探究。

因为小麦是异源六倍体且含有大量的重复序列，研究人员巧妙地利用基因组已测序的小麦二倍体祖先粗山羊草（Aegilops tauschii）为研究对象评估响应白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）侵染对其DNA甲基化程度的影响。因为许多可以感染小麦的Bgt小种也可感染粗山羊草，而且通过杂交也可将粗山羊草中抗病性状导入普通小麦中，因此认为粗山羊草和普通小麦具有相似的防御系统。

首先作者确定优质的接种后观察和研究时间。作者分别选取了感病和抗病的两个材料AL8/78和Y2280，通过接种后的6小时、12小时、和24小时显微观察Bgt的形态，作者发现24小时之后次级菌丝（Hy）已经在AL8/78中观测的到，说明接种成功。通过比较，发现接种12小时感病材料和抗病材料的菌丝生长已经表现出差异性，因此作者在后续的研究中，选用接种12个小时后的材料进行后续分析（Fig. 1 a）。根据以往水稻中的研究，AGO4有两个同源基因AGO4a、 AGO4b，在粗山羊草中同样发现了AGO4a、 AGO4b。qRT-PCR分析显示，无论是AL8/78还是Y2280，AGO4a都显著下降，而AGO4b只在Y2280中有显著性差异（Fig. 1 b）。预示着AGO4a的表达只与Bgt的侵染有关而与材料背景无关。PR5基因的表达升高，表明侵染成功。从这个结果来看，AGO4a与白粉菌的抗性相关而且其在普通小麦和粗山羊草中都是保守的。

在RdDM中，AGO4的主要功能是与24nt-siRNA结合形成RISC（RNA-induced silencing complex）从而完成特定序列的DNA甲基化。因此作者也想探究一下Bgt的侵染是否也会影响到与AGO4相关的siRNA。作者首先根据AGO4a和AGO4b的N端序列构建了两个抗体，并通过免疫印记的方法进行了验证（Fig. 2 a、b）。随后作者对纯化到的AGO4a进行质谱分析，获得其序列（Fig. 2 c）。对于sRNA的分析，作者选用2周的植物的叶片进行Bgt的侵染，分别处理0小时和12小时，利用免疫沉淀和二代测序，每个样品获得了10M的reads数。通过统计AGO4a pull down的sRNA，其68-92%都是24nt大小（Fig. 2 d），而在不利用pull down,检测的sRNA，21nt的sRNA与24nt的sRNA相似（Fig. 2e）。有趣的是，当我们对pull down的sRNA 进一步研究时发现，无论是抗病还是感病材料，接种Bgt后，24nt的sRNA都有一定程度的下降。同时发现，AGO4a结合的sRNA主要都是首个核苷酸是A的sRNA，而AGO4b和总的sRNA都不存在对A的偏好性（Fig. 2f、g）。随后对AGO4a关联的sRNA对其在基因组上的分布进行统计，65.8%的24-nt sRNA分布在基因间隔区，22.8%分布在TEs区，11.1% 分布在基因区（Fig. 2 h）。根据已有的研究，甲基化的TEs调控了其附近基因的表达，作者发现在TEs上下游2Kb范围内，超过70%的基因与之相关，称之为TAGs（TE-associated genes），作者对TAGs的24nt-sRNA分布密度进行统计，发现感病品种AL8/78在接种0小时和12小时其TAGs的siRNA密度存在差异，而在抗病品种Y2280中差异更大。对于非TAGs，无论什么品种，其差异性都不大（Fig. 2 I,j）。结果表明，接种Bgt降低了AGO4a相关联的24nt siRNA 的水平。

RdDM途径中，AGO4与siRNA结合，诱导DNA的甲基化，从而导致附近基因的沉默。作者试图去探究Bgt的侵染是否会影响甲基化相关基因的表达，作者研究了DNA甲基化酶DRM2，发现其显著的降低，而CMT2、CMT3、和MET1都有所下降，但是差异不显著（Fig. 3 a）。这与在普通小麦种的研究现象相同，意味着在这两个物种中，DNA甲基化酶同源基因高度保守。作者随后以AL8/78为材料，研究了接种12小时（B12）与不接种（M12）的不同处理下DNA甲基化水平。在M12和B12材料中，分别有1222M和824M的reads被获得。高的甲基化位点为CG，分别为87.1% 和96.4% ，其次为CHG，低的为CHH，在M12和B12中仅仅为1.9%和1.6%（Fig. 3b）。DNA甲基化调控基因的表达是通过调控基因编码区附近的DNA序列的甲基化来实现的，因此作者也对基因不同区域的甲基化水平进行了统计。在基因区的甲基化水平远低于全基因组水平，且基因编码区更低（Fig. 3c）。作者随后以100bp的窗口大小检测C碱基的甲基化水平，在CG、CHG、CHH位点甲基化差异达到0.4、0.2、0.1的认为是DMRs，在这个标准下，只有138个CG位点DMRs，132个CHG位点DMRs，数目较少。但是在CHH位点，发现了14869个DMRs（Fig. 3d）。这表明，在粗山羊草与Bgt互作的过程中，CHH位点是主要的甲基化位点。在对DMRs关联的基因分析时发现，4366个基因与CHH低甲基化有关，362个基因与CHH高甲基化有关，对比CG、CHG、CHH不同位点的DMRs关联基因，只有6个基因与三者的低甲基化共同关联，没有共同的基因与三者的高甲基化关联（Fig. 3e,f）。对DMRs在基因上的位置探究，发现CHH无论高甲基化还是低甲基化DMR主要集中在基因的上下游区域（Fig. 3 j,h）。这与此前在水稻和大豆中观察的现象一致。对CHH低甲基化基因和TAGs基因关联，发现1228个基因被两者相关联（Fig. 3i），对其GO注释，发现在\"次生代谢”和\"刺激胁迫”功能富集（Fig. 3j）。通过ManMap分析，基因主要功能包括胁迫，信号通路、细胞壁通路相关（Fig. 3 k）。

既然已经发现接种Bgt导致DMR2基因表达降低从而导致抗性增强，作者就想验证是否可以通过人为降低DRM2的表达从而提升其抗病性。作者构建了VIGS诱导DRM2表达降低植株BSMV：DRM2-1、BSMV：DRM2-2，首先验证BSMV构建成功（Fig. 4 c、d），对其植株表型（Fig. 4 a）和萌发后芽孢（Fig. 4 b）鉴定，证明其确实抗性增强。对于DRM2及其同源基因DRM3的表达水平统计，发现DRM2显著下降，但是DRM3并不存在差异（Fig. 4 e）。

为了进一步验证CHH甲基化的改变影响了对Bgt的抗性。我们通过进化树找到与PR2同源的基因AeGlu（Fig. 5 a），发现在VIGS诱导DRM2表达降低植株BSMV：DRM2-1、BSMV：DRM2-2中该基因都显著的上调（Fig. 5 b）。检测其在启动子区的L1-like TE和在第一内含子区的两个stowaway-like MITES。作者对siRNA的分布（Fig. 5 c line 1、2）以及不同的甲基化类型（Fig. 5 C line 3-8），发现MITE与一个CHH低甲基化DMR相关，而CG、CHG并没有改变。并通过亚硫酸盐处理进行测序分析，发现CHH甲基化在该区域确实降低（Fig. 5d,e）。通过瞬时表达，共表达AeGlu和GUS，吸器指数相较于空载降低（Fig. 5f）。综合分析以上结果，CHH 低甲基化诱导AeGlu表达，从而提高对Bgt的抵抗。

总的来说，作者以RdDM途径上的不同参与者为切入点，从AGO4、24nt-sRNA、DRM2不同处理下的差异，进而研究DNA的甲基化对粗山羊草的Bgt的抗性，结果表明，DNA甲基化的动态变化调控了植物的免疫。鉴于近期普通小麦基因组图谱绘制的完成，我们相信会有越来越多的研究对小麦抗病机制进行多方位阐述，而其中，表观遗传的调控也一定会在其中大显身手。武汉爱基百客作为一家专业的表观遗传学服务公司，旨在为客户提供优质专业的表观组学技术服务，期待与各位老师共同携手，探索生命的奥秘。

原文：DNA methylation dynamics during the interaction of wheat progenitor Aegilops tauschii with the obligate biotrophic fungus Blumeria graminis f. sp. tritici（doi: 10.1111/nph.15432）

原文链接：https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/nph.15432

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