发布日期：2009-05-08来源：生技网信息中心浏览次数：234四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 操作步骤 一、接种细胞1、用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝操作步骤一、接种细胞1、用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。 2、离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。 3、将细胞稀释至2.5 103-50 103 个/ml，每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。 4、用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5 103-10 103 个细胞。 5、将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。 6、将培养板放至塑料饭盒中，于37 湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。二、添加药物1、用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。 2、对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。 3、在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。 4、在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。 5、向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。 6、将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。三、生长期1、在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。 2、每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。四、存活细胞数的估算1、在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。 2、用铝箔包裹培养板，于37 湿润环境中温育4 h。 3、弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。 4、在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。 5、立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。五、分析以药物浓度为横坐标（X轴），吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50浓度。四唑盐比色法的原理活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。无菌材料生长液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L，溶于PBSA中）；MTT： 3- (4，5) -双甲基 - 2 -噻唑 -(2 ，5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml，滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液（0.1mol/L甘氨酸，0.1mol/L NaCl，用1mol/L NaOH将PH调至10.5）；微滴定板（Linbro，ICN）；微吸头，最好放在高压灭菌的吸头盒中。非灭菌材料塑料盒（无毒的聚苯乙烯，装培养板用）；加样关于MTT实验的总结发布日期：2009-05-08来源：生技网信息中心浏览次数：192MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT噻MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。MTT步骤：1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。MTT注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度。2、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中：Xm:lg最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值。公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 。Pm=0.95；Pn=0.06；P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1；Xm=lg0.1=-1；lgI=lg0.1/0.01=1；lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025；IC50=0.00025例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO，加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150μlDMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（AnnexinV），细胞周期的亚G0峰比较明显。有一点看法：我觉得做任何实验都需要摸索适合你的实验的条件，不能用一个protocol去套所有的实际。拿MTT来说，这个实验是间接检测活细胞数目的，而需要确定活细胞数目的实验的目的是各种各样的。在不同的目的下，就需要不同的条件。以药物筛选来说，为了准确评价药物的作用，培养时间仅用3～5天可能是不够的；对于某些细胞来说，加药培养时可能用维持培养基或无血清培养基更合适。因此，诸如MTT和DMSO加入量、孵育时间等应因事而异，找到最适合你实验要求的就好。