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性能参数

鸽肉含有多种氨基酸、维生素及微量元素；鸽蛋也是养生、滋补的佳品。随着国内外鸽子市场消费水平的增长，越来越多的商家投入到鸽子生产中，鸽子的繁育和发展受到了更多的关注。鸽子属于单态性鸟类，即雌雄性别在外观上表现一致。鸽子还是典型的\"一夫一妻”制的繁殖方式，如果性别比例不当，不仅会使鸽群不安定，还会影响繁殖，降低产蛋率，所以雌雄鉴别在鸽子养殖业中具有重要作用。

鸽子作为晚成鸟，雏鸽体型小且雌雄外貌形态差别甚微，不像一般家禽可以从外形上区分雌雄。因此，人们对鸽子的雌雄鉴定主要依赖分子生物学方法，而其中CHD-W基因鉴定法最为常用。CHD1(chromo-helicase-DNA binding protein-1)在非平胸鸟类的Z、W染色体都有分布，两者的外显子序列和大小相似，内含子大小却有很大差别。国内外学者根据这个特性，利用内含子两侧保守序列设计特异性引物，使用PCR方法对CHD-W进行扩增，用于多种非平胸目鸟的性别鉴定，并取得了显著进展。

然而，一方面现有的引物主要针对普遍的非平胸目鸟类，与特定鸟类的基因吻合度低，PCR效果较差；另一方面现有的引物扩增雌性两条带大小差别不大，不易区分，容易造成判断失误；而且，在鸽子基因组DNA的提取过程费时费力，还容易造成样品污染，影响检测结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种技术实用性强、重复性好、效率高的直接对血液扩增鉴定鸽子性别的方法。该方法既可节约鸽子基因组DNA提取的成本，降低样本污染的风险和假阳性的概率，又可以用于鉴别外观上难以区分性别的鸽子的性别鉴定。

本发明的目的之一是提供一种鉴定鸽子性别的引物对。该引物对为：

上游引物CHd-WL1(SEQ ID NO：1，5’CTCTGGGTTTTGACCAACTA3’)；

下游引物CHd-WR1(SEQ ID NO：2，5’ATATCTTACCGCCTGATCTC3’)。

本发明的目的之二是提供一种鉴定鸽子性别的PCR试剂盒。该试剂盒包括：所述引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、LA PCR buffer、dNTPs、PEC-1和Omni Klentaq。

最后，本发明的目的提供一种鉴定鸽子性别的方法。具体步骤如下：对NCBI数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对，确定较为保守的区域，设计一对原创性引物对，引物对名称为CHd-WL1(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和CHd-WR1(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于鸽子性别的分子鉴定。采集鸽子翅静脉的新鲜血液或者抗凝管(EDTA)收集的冻存血，利用该引物对进行PCR扩增，PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳后扩增产物为单一条带，可以判定该个体为雌性；电泳后扩增产物无条带，可以判定该个体为雄性。

与现有技术相比，本发明直接使用鸽子血液进行PCR检测，不仅节省了成本和劳动时间，还降低了样本污染的风险和假阳性的概率；在保守区域设计引物用于鸽子性别的鉴定，PCR扩增效果好，电泳检测条带清晰，结果易读，可以准确地判定鸽子性别；本发明设计引物通用性强，适用于鸽子品种包括但不限于白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽等。本发明使用血液直扩鉴定鸽子性别，是一种技术实用性强、重复性好、效率高的的方法。

附图说明

图1实施例中鸽子血液直接PCR产物电泳后的图谱；其中电泳图谱第一行：白卡1-8为白卡鸽，深王1-8为深王鸽，白王1-8为白王鸽；电泳图谱第二行：银王1-8号为银王鸽，泰森1-8为泰森鸽，B为空白对照。图中M为marker，♀为雌性，♂为雄性。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例

1、鸽子血液采集

本发明的样品来源于鸽子5个品种：白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽，每个 品种雌雄各4只。先将鸽子侧卧保定，露出腋窝处，拔去该部羽毛，可见翼下静脉，压迫翼下静脉的近心端，使血管怒张，消毒后，手持采血针由翼根向翅膀方向沿静脉平行刺入，采完后要压迫止血。采集的血液可直接检测或者抗凝管(EDTA)收集-20℃冷冻保存。

2、引物设计

对NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对，确定保守的区域，利用primer5.0设计一对原创性引物对：CHd-WL1(核苷酸序列SEQ ID NO：1 CTCTGGGTTTTGACCAACTA)和CHd-WR1(核苷酸序列SEQ ID NO：2ATATCTTACCGCCTGATCTC)，该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于鸽子性别的分子鉴定。

3、PCR扩增

20μl反应体系中加入鸽子血液0.8μl、LA PCR buffer 2μl、上下游引物各0.6μl、dNTPs 1μl、PEC-15μl、Omni Klentaq 0.3μl、ddH2O 9.7μl。其中：LA PCR buffer来自宝生物工程(大连)有限公司的10×LA Taq Buffer II(Mg2+plus)(Code No.9153A)，dNTPs购于宝生物工程(大连)有限公司(Code No.4030Q)，PEC-1增强剂购于VitaNavi Trchnology(VN260P)，Omni Klentaq直扩酶来自美国Enzymatics公司的Omni(P7500-HC-F)，ddH2O为高压灭菌的去离子水，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，工作浓度为10μM。表1是PCR的反应体系。

PCR反应条件为：98℃5min，35个循环：95℃30s，54℃30s，72℃45s，后72℃延伸5min，反应产物于4℃保存。

表1

4、性别鉴定

将PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。鸽子性别鉴定检测结果如图1所示：其中电泳图谱第一行：白卡1-8为白卡鸽，深王1-8为深王鸽，白王1-8为白王鸽；电泳图 谱第二行：银王1-8号为银王鸽，泰森1-8为泰森鸽，B为空白对照。图中M为marker，是天根生化科技(北京)有限公司的100bp DNA ladder，♀为雌性，♂为雄性。从扩增产物电泳图谱可知：扩增产物电泳为单一条带的是雌鸽，长度约370bp；扩增产物电泳无条带的是雄鸽。

5、序列分析

由于雄性鸽子不能扩增出目的条带，因此我们将经过鉴定的雌鸽样本的PCR扩增产物送华大基因测序，以验证性别鉴定的准确性。雌鸽样本的PCR扩增产物测序峰图使用Chromas软件查看，测序碱基序列结果使用DNAMAN软件查看，并使用DNAMAN软件将鸽子的测序碱基序列和NCBI数据库公布的多种鸟类的CHD1序列进行对比分析，结果显示扩增序列与参考序列有很高的一致性，说明我们扩增的序列为CHD1基因，进而说明我们设计的引物性别鉴定的结果是真实可靠的。

本发明方法技术实用性强，重复性好，效率高。直接使用鸽子血液进行PCR检测，不仅节省了成本和劳动时间，还降低了样本污染的风险和假阳性的概率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种直接定量检测循环m i RNA的RT-qPCR方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接定量检测循环miRNA 的RT-qPCR方法。

背景技术

[0002] MicroRNA (miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线 虫等真核生物中。miRNA通过与祀mRNA的3’端非翻译区（3’ -UTR)结合，降解祀mRNA或者阻止 其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上，miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、 凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控，具有严格的时空特异性。 研究发现，血液中存在着循环miRNA且非常稳定，更为重要是，循环miRNA的异常与许多疾病 的发生发展密切相关，可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。

[0003] 长期以来，基于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的 miRNA检测手段之一，比较常用的有poly (A)加尾法（Shi R，Biotechnique · 2005，39 (4): 519-525)和茎环引物（Stem loop)法（Chen C，Nucleic Acids Res.2005,33 (20): 1-9)。 Poly⑷加尾法是利用poly⑷聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly⑷尾巴，然后用含有 Olig0 (dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，因此Poly㈧加尾法在降低检 测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个 茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基，可以特异性的进行逆转录反 应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂 贵，此外，依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的，会显著降低cDNA合成的效率。

[0004] Kang K等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly⑴法，分别在其专利申请 CN102154505A (在该专利中称为S-S-Oligo (dT)法，所用引物称为S-S-Oligo (dT)引物)和文 章(Kang，K，PloS one.2012.7，e48536.)中进行了公开。在S-Poly⑴方法中，所用引物从5’ 端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列，14-20个碱基的通用探针序列，8-30个dT及 与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly㈧加尾法和茎环引 物法相比，S-Poly (T)方法的特异性和灵敏度都大大提高，灵敏度至少提高10倍以上。在升 级版的S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号:201510558101.5)，miRNA的Poly㈧加尾和逆转 录一步反应完成，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly⑴Plus技术又有进一步改 进和提高，其总体灵敏度比S-Poly (T)方法提高2-8倍。

[0005] 现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收 的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程费时，易造成污染和降解。

[0006] 可见，现有技术还有待完善。

发明内容

[0007] 鉴于此，有必要针对上述问题提供一种不需提取核酸，更为简便、灵敏、高效、廉价 的直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，称之为Direct S-Poly (T) Plus (DSPP)。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：

[0009] 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，所述方法不需提纯核酸，将miRNA从 蛋白复合体中裂解出来，直接进行RT-qPCR检测。

[0010] 进一步的，所述直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，包含以下步骤：

[0011] S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样 本中的蛋白复合体中释放出来;将所得的混合物离心，得上清即为粗提RNA，40u 1的混合物 可以吸取约35ul上清；

[0012] S2、加尾逆转录:将所述步骤Sl中所获得粗提RNA进行加Poly (A)尾及S-Poly⑴特 异性逆转录；

[0013] S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定 量检测。

[0014] 进一步的，所述步骤Sl中所述样本用量为20〜50ul。

[0015] 进一步的，所述步骤Sl中裂解用试剂包括组分:20ul 2Xlysis buffer、lul蛋白 酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本。

[0016] 进一步的，所述2 X lysis buffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、 300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pHS8.0。

[0017] 进一步的，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0018] 进一步的，所述裂解条件为50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。

[0019] 进一步的，所述步骤Sl中的离心条件为：10,000〜14,000g，4°C条件下离心5〜15 分钟;优选13，OOOg，4°C条件下离心5分钟。

[0020] 进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase)和逆车专录酉每（reverse transcriptase) 〇

[0021] 进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分 比为5〜75%，优选40 %。

[0022] 进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含:0.5-7.5uL上清模板、1 ±0.2yL的0.5 ymol/L RT primer、l±0.2U的PolyA Polymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的 reaction buffer、RNase_free Water补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37〜42°C保 温50〜70min，74〜76°C保温3〜7min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0023] 进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：4uL上清模板，IyL的0.5μΜ RT primer，IU的PoIyA Polymerase，100U的MMLV，1·5yL的reaction buffer，RNase-free Water补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保温 5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0024] 进一步的，所述步骤S3中以cDNA为模板进行real-time PCR定量检测，此过程使用 的DNA聚合酶为热启动酶，目的是减少非特异性扩增;real-time PCR反应体系为:4XqPCR reaction Buffer:5yL、lymol/L Forward Primer 4yL、10ymol/L universal reverse primerO.10ymol/L universal Taqman probe0.5yL、100XROX Rerference DyeO.2μ L、hotstart Alpha Taq PolymeraseO.0125yL、cDNA0.5yL、RNase_free Water加至20yL;反 应条件为:预变性95 °C 5分钟，变性95 °C I Os，退火60 °C 40s，40个循环。

[0025] 进一步的，所述热启动酶的制备方法为:将DNA聚合酶和热启动抗体等体积混合， 室温放置6小时。

[0026] 进一步的，所述样本包括血清、血浆/血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽 提上清;优选样本为血浆。

[0027] 本发明有益效果：

[0028] 1、本发明Direct S-Poly (T) Plus方法中，不需要提取核酸的步骤，定量检测 miRNA，其流程图如图1所示。操作简便，缩短时间，制备cDNA的时间至少减少70 %以上，简便 性优于传统方法。

[0029] 2、本发明Direct S-Poly⑴Plus方法在逆转录这一步对于模板量要求范围更宽， 5%-75%的粗提RNA均可满足逆转录要求，转录效率优于传统方法。

[0030] 3、本发明中的技术体系尤其适合于从m i RNA丰度较低的生物体液样本中检测 miRNA。本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方面，20ul的体液样本就可以 实现175个miRNA的检测。

[0031] 4、本发明Direct S-Poly (T) Plus方法能从包括血清、血浆/血清、尿液、乳汁、唾 液、痰液、粪便抽提上清及细胞培养液等生物体液样本中高效检测miRNA，检测效率比传统 方法高出一个数量级，从而提高了体液miRNA定量检测的灵敏性和准确性。

[0032] 5、本发明的简便性、灵敏性和特异性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面 有重要应用前景，可广泛用于肿瘤、心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。

附图说明

[0033] 图1为miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测流程(Direct S-Poly⑴Plus)。其中，在加 尾逆转录体系中，4u 1粗提RNA作为模板为最优方案。

[0034] 图2为Direct S-Poly⑴Plus方法中不同裂解方案的效果比较。

[0035]图3为Direct S-Poly (T) Plus方法中一步法(加尾和逆转录反应一步完成)和两步 法(先加尾后进行逆转录反应)的差别。

[0036] 图4为Direct S-Poly⑴Plus方法中起始粗提RNA加入比例。

[0037] 图5用Direct S-Poly (T) Plus比较同一志愿者的血清血浆中miRNA表达量。***P〈0 · 001 〇

[0038] 图6以提取的RNA为模板，用S-Poly (T) Plus方法比较同一志愿者血清和血浆中 miRNA的表达量。用miR-cel-54做归一化内参，*#P〈0.001。

[0039] 图7为热启动Alpha Taq Polymerase对Direct S-Poly⑴Plus方法中非特异性扩 增减少作用。

[0040] 图8为hsa-miR-15b_5p扩增曲线，-RT :不加逆转录酶的阴性对照，检测方法为 Direct S-Poly⑴Plus。

[0041] 图9为热启动Alpha taq polymerase用量对miRNA检测Ct值的影响（20ul体系），检 测方法为Direct S-Poly (T) Plus。

[0042] 图 10为使用0.4ul Hotstart Alpha Taq Polymerase miRNA的阴性对照（不加逆 转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为Direct S-Poly⑴Plus。

[0043] 图 11 为使用0.0125ul Hotstart Alpha taq Polymerase miRNA的阴性对照（不加 逆转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为Direct S-Poly⑴Plus。

[0044] 图12为Direct S-Poly⑴Plus方法的灵敏度和线性范围。

[0045] 图13为三种miRNA检测方法灵敏度比较。

[0046] 图14为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为 Direct S-Poly ⑴ Plus。数据为土 SE，**P〈0 · 01，***P〈0 · 001，ns，不显著。

[0047] 图15为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为S-Poly ⑴ Plus (内参为miR-cel-54)。数据为土 SE，**P〈0 · 01，***P〈0 · 001，ns，不显著。

具体实施方式

[0048] 为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结 合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施 例及其组合实施方式。

[0049] 如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市场销售，所采用的方 法均为常规方法，其中引物、探针来自美国Integrated DNA Technologies (IDT)公司。

[0050] 本申请中主要材料来源如下：

[0051] 血液来源于深圳市人民医院和北京大学深圳医院。血浆收集流程为:采血于含有EDTA 抗凝剂的采血管，4°C，3，000转离心10分钟，上清即为血浆;全血样本室温放置1小时，取血清4 °C，3，000转离心10分钟，上清即为血清。血清/血浆样本分装为20-50ul的体系，保存于-80 °C。

[0052] miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测方法(Direct S-Poly (T) Plus)最优方案流程如 图1。在最优的方案中，20ul的血浆可以制备35ul粗提RNA，对应87.5ul cDNA。按照20ul qPCR体 系加入0.5ulcDNA，平均可以检测175个miRNA。忽略操作时间，整个miRNA检测流程只需140分钟。

[0053] 实施例I Direct S-Poly⑴Plus方法比较血浆和血清中的循环miRNA含量

[0054] 在本实施例中，同一志愿者血清和血浆同时作为模板，共收集了同一健康志愿者 的血清和血浆样本10对。用本发明中DirectS-Poly (T) Plus方法分别检测等量血清或者血 浆样本中的miRNA表达量。具体包含以下步骤：

[0055] Sl、裂解离心，具体步骤为：

[0056] I) 20uL血楽_/血清与20uL 2X lysis buffer混合均勾，加入IuL蛋白酶K，50°C处理 20分钟，然后95 °C保持5分钟，置于冰上；

[0057] 2)13,00(^，4°(：离心5分钟；吸取上清液(粗提1?熟)转移至另一新的离心管中或直 接用于S2;

[0058] S2、加尾逆转录:miRNA加Poly (A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体 系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0059] 所述2 X lysis buffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/l NaCl、20mmol/l MgCl2; pH为8 · 0;所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0060] 加尾逆转录的反应体系包含：4uL粗提RNA，lyL的0.05μΜ RT primer (逆转录引 物），IU的PolyA Polymerase (多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV (鼠白血病逆转录_，1 · 5yL 的reaction buffer (反应缓冲液），RNase_free Water (无RNA酶水）补足至10yL。所述 reaction buffer包含以下终浓度的组分：200mM Tris_HCl，600mM NaCl，40mM MgCl2,4mM ATP，2mM dNTP，pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保 温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0061] 所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14-20个碱基的 PCR通用引物序列、14-20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5-7个与miRNA 3’配对的 特异性碱基。更优选地，所述S-Poly⑴引物序列从5’端到3’端依次为：16个碱基的PCR通用 引物序列、17个碱基的通用探针序列、11个oligo (dT)和6个与miRNA 3’配对的特异性碱基。 [0062] 本发明中所检测的miRNA的序列来自于miRBase，根据各自序列设计不同的S-Poly ⑴引物、上游引物，检测不同miRNA的S-Poly⑴引物序列如表1所示。

[0063]表1、本发明中所使用的引物和探针

[0066] S3、PCR:以步骤S2中逆转录获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下 游通用引物进行real-time PCR定量检测。所述miRNA特异上游引物是不含3’端3-8个碱基 的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Poly⑴引物的14-20个碱基的通用 引物序列。

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