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测序实验流程：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）间接法测抗体
1．酶标抗抗体工作浓度的选择（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸亮度（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1 g/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作zui适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1 g/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。ELISA（酶联免疫吸附剂测定）的基本原理有三条：1. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；2. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；3. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。【生物分子】 抗生素/抗真菌素 维生素 氨基酸 核苷酸 脂 糖类 白三烯 前列腺素 药物结合物 抗氧化剂 药理活性化合物 类固醇激素结合物 半抗原反应 半抗原载体结合物 放射性核素 血小板活化素 tRNA 活性染料和化合物 亲和素/链霉亲和素
【蛋白质/抗原/多肽】 免疫球蛋白 封闭肽 人蛋白和抗原 小鼠蛋白和抗原 细菌蛋白和抗原 病毒蛋白和抗原 植物蛋白和抗原 其它蛋白和抗原 细胞质蛋白 总蛋白 膜蛋白 核蛋白 细胞裂解和提取物 线粒体蛋白 细胞裂解 组织提取 重组细胞因子【常用生化试剂】EDTA DTT Tris SDS MOPS HEPES 水 分子生物学缓冲液 蛋白生化缓冲液 去垢剂 染色试剂 溶剂 酸碱 化学试剂 其它生化试剂【PCR/RT-PCR/qPCR】PCR试剂 PCR对照 特异性PCR试剂盒 PCR克隆试剂盒 RNA 载体及构建 PCR克隆载体 M13克隆载体 细菌克隆载体 文库及构建 cDNA文库 基因组文库 噬菌体展示文库【酶】限制性内切酶 蛋白酶 核酸酶 激酶 聚合酶 连接酶合成纯化
