基于PLGA与PEG纳米基因载体的制备

材料

试剂

琼脂糖凝胶（1%)

乙醇

乙酸乙酯

二氯甲烷

磷钨酸染色溶液（2%)

Picogreen试剂（Molecularprobes，Invitrogen)

质粒：pCMV-(3-gal载体（ElimBiopharmaceuticals)

Poloxamer:具有不同的亲水-亲油比值（HLB)，及不同的链段长度PiuronicF68与PiuronicL121(BASF，Germany)

Poloxamine:具有不同的亲水一亲油比值（HLB)，及不同的链段长度Tetronic904-¾Tetronic908(BASCOM,Belgium)

聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物（PLA-PEG，Alkermes，Ohio)

聚乳酸-聚轻基乙酸共聚物（PLGA，BoehringerIngelheim)

聚乙烯醇（PVA)溶液（1%与0.3%m/V)

ELISA试剂

仪器

琼脂糖凝胶电泳设备与ELISA用酶标仪

超声波破碎仪（Sonifier，Branson,Barcelona,Spain)

荧光分光光度计

透射电子显微镜

真空干燥箱

粒度-表面电位仪Zetasizer3000HS(MalvernInstruments)

方法

纳米颗粒的制备

1.特定组成的纳米颗粒的制备PLGA/PEO衍生物的共混物纳米颗粒

通过溶剂置换技术制备。

a•将500邱的质粒DNA溶于200ul的水相中。

b.将50mg的PLGA与50mgPEO衍生物溶于2ml二氯甲烷中。

c.将步骤a形成的水相与步骤b形成的油相混合，涡旋，形成油包水的乳液。

d.向乳液中加人25ml极性溶剂（如乙醇)，使聚合物以纳米颗粒形式沉淀。

e.加入25ml水，并让有机溶剂充分挥发。收集纳米颗粒悬液。

PLA-PEG纳米颗粒

可以用上述溶剂置换技术制备，也可以用双乳液技术制备。

a•将200ug的质粒DNA溶于2(%1的水相中。

b.将4Omg的PLA-PEG溶于I.5ml乙酸乙酯：二氯甲烷（I:1)的混合溶剂中。

c.步骤a形成的水相与步骤b形成的油相混合，超声5s。

d•将上述乳液加人到PVA的水溶液（l%；n/V)中，超声5s(输出功率=10)，形成双乳液（水包油-油包水)。

e.将上述乳液在揽拌下加人到50ml0.3%(m/V)的PVA水溶液中，轻微搅拌，以使纳米液滴固化。

f.真空下蒸发除去有机溶剂。

纳米颗粒的分离

2,15°C，10〇〇〇g的转速离心让分离纳米颗粒。

这样的条件可以使纳米颗粒最大量的沉淀，而不会使游离的质粒DNA沉淀。

3•用水重悬纳米颗粒，轻轻振动或涡旋。

竭米颖粒的表征

4•利用粒度分析仪测纳米颗粒的粒径（ZetasizerHS3000)。

5•用ZetasizerHS3000测试电势及分布。

6.通过磷钨酸染色溶液（2%)染色，用透射电子显微镜观察纳米颗粒的大小和形态。

7•采用PicoGreen荧光试剂，根据试剂提供商提供的操作方法，用荧光光度计测量

DNA的结合效率（MolecularProbes，Invitrogen)。

8.通过1%的琼脂糖凝胶电泳分析释放的质粒DNA或从纳米颗粒萃取的质粒DNA的结构完整性。

体内基因表达

体内基因表达可以通过检测小鼠对编码蛋白质的免疫反应来研究。

9•每隔15min向小鼠（6〜9只）鼻腔中滴人IOfJ悬浮的纳米颗粒（总量为25ugCMV-p-gal，每个鼻腔3滴)。

10.在预定时间点从小鼠尾静脉取血，4°C,3000g离心5min，收集血清，一20°C储存。

11.ELISA法测定IgG与IgA的水平。