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流式检测细胞周期

线粒体膜电位(MMP):

使用几种染料中的其中一种就可以检测到细胞在凋亡过程中MMP的降低,如双氰基-双己氧基羰基靛蓝,它能够隐藏在活细胞的线粒体内。当MMP体系崩溃时,细胞的荧光就会减少。

磷脂酰丝氨酸(PS)在细胞表面的分布情况:

PS一般分布在质膜的内侧上。在细胞凋亡过程中,PS残余物会曝露在细胞表面。这种变化可以通过复合蛋白钙依赖的磷脂结合蛋白VPS结合来进行检测。所使用的细胞必须是未经修复的,因为钙低速的磷脂结合蛋白V不能到达完整细胞的内部。PI常被用来加到二次坏死细胞中来进行鉴别。

DNA消化:

在最新的细胞凋亡的一系列反应过程中,一种特异的内切核酸酶能够将染色体这间的连接点打断,形成大量的小片段,这些小的片段是一些低聚体,其大小约为180bp。可以通过以下两种方法对DNA链的断裂进行检测:观察DNA柱状图的sub-G1顶点;用脱氧核糖核苷末端转移酶对DNA链的断口进行标记(TUNEL检测)。

Sub-G1点:

如果细胞在乙醇中固定,随后再水合时,一部分低分子量的DNA会被滤掉,以降低DNA的含量。这些细胞会在DNA柱状图中作为独立的峰被观察到。

TUNEL检测:

DNA链的断裂末端可以通过酶标记作用进行标记。在70%乙醇中固定之前,细胞在1%多聚甲醛中固定以将小的DNA片段结合到细胞中去,然后和Tdt以及一种已标记的核苷一起进行培育。所用的这些核苷包括:地高辛-dUTP,用经FITC标记的抗地高辛配基进行检测;生物素-dUTP,用经FITC标记的抗生素蛋白进行检测;溴-dUTP,用抗BrdUrdFITC进行检测。

在加入PI标记DNA后,绿(FITC)与红(PI)相对的荧光能够进行记录。凋亡的细胞会发出绿色的荧光,经染色过的DNA表明从凋亡的细胞中的细胞循环间隔会被诱导产生。

细胞生长及死亡:

组织的发育和肿瘤的生长在细胞分裂和死亡的平衡是同样的。在许多细胞动力学研究中,它们具有同样重要的地位。细胞仪和部分多功能流式细胞仪在程序上给予新的视觉。

细胞生长:

细胞增殖可以通过研究来进行检测:细胞周期;细胞通过细胞周期的运动率;细胞周期相关蛋白;长期标记物的稀释

DNA图示:

细胞通过用DNA结合染料进行染色,如PIDNA图示:能够作出对细胞在细胞周期G1/G2SG2/M阶段的产量的评估;不能很好地提供有关细胞通过细胞周期的运动信息;能够较易地进行免疫荧光结合染色;应一直作为很多研究领域中的首选检测方法。

细胞周期中的细胞运动率:

这里提供两种常用的检测方法:在细胞用BrdUrdPI标记的抗体标记后,再经溴代脱氧尿苷(BrdUrd)进行脉冲标记。接着用Hoechst 332588PI和二苯甲酰胺标记DNA方法用BrdUrd对细胞进行标记。

BrdUrd进行脉冲标记:

经脉冲标记后,细胞在S期就包含有BrdUrd。通过细胞周期的细胞运动可以通过以下方法进行检测。分析方法如下:动态的,在那些细胞周期进程中可以观测得到;更复杂,因为在和抗体一起培育之前必须将DNA变性;因而很难结合另外的抗体标记;可以用来对动物肿瘤进行细胞动力学研究。

BrdUrd/Hoechst/PI法:

在紫外线的激发下,结合到DNA上的Hoechst 332588会发出蓝色的荧光。这种染料会优先结合到DNA上的富AT区域,它的荧光会被BrdUrd淬灭。PI散发出的荧光可以帮助鉴别细胞周期的各个阶段;蓝色荧光可以检测BrdUrd在细胞中的含量以及其在S期中存在的时间。这种方法是:动态的;简化的;需紫外仪,但并不适用于所有的流式细胞仪;在需要两种激光的情况下,很难与免疫荧光染料结合。

细胞周期相关蛋白:

在细胞周期过程中,有几种蛋白质家庭对细胞周期的进程进行控制。如果有一个合适的抗体存在时,它们的细胞周期分布将能够被检测出来。

稳定标记物的梯度变化:

这里有几种荧光复合物可以对细胞蛋白进行稳定的标记,如双乙酸基羰基荧光素,琥珀脂。当细胞分裂时,标记物会被分配到两个子细胞中去。一些细胞如淋巴细胞会精密地分配标记物。目前只能追踪到大约5次的细胞分裂。人工培养的细胞通常会对标记物有一个宽的分配和对分裂的细胞个体之间加以区别以做便更好地定义。这种方法不能对细胞周期的间期进程提供更多的信息。

坏死:

坏死通常被定义为细胞膜的完整性的破坏。一些结合有染料的DNA会被活细胞释放出来,但却会被死细胞吸收。另外的染料会被活细胞所保留但在死细胞中会丢失,如羰基荧光素。因此,染料的结合常被用来检测死细胞的数量。

凋亡:

流式细胞仪可以追踪细胞在调亡过程的一系列反应过程中的许多不同的组分。一些部分重要的检测会在下面被提及。