腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链 DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近 50 个血清型，大多数腺病毒载体都 是基于血清型 2 和血清型 5，通过转基因的方式取代 E1 和 E3 基因，降低病 毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达 E1 和 E3 基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达 的工具，功能强大并易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为\"载体的 首选”，被科研工作者广泛应用。腺病毒主要具有以下特点：1．可广泛地感染各类细胞，包括分裂细胞和不分裂细胞（某些抗腺病毒感 染的淋巴瘤细胞除外）；2．高效率地感染细胞，感染率可达100%；3．可达到较高的病毒滴度，一般粗病毒可达1011vp/ml， 而浓缩后可达1013vp/ml；4．易于扩增；5．不整合到染色体中，无插入致突变性；6．稳定保存，-80 ℃可以保存2年以上。维真生物生物使用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒。该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可 在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因不影病毒的包装。由于 E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。维真生物生物的ORFAD-腺病毒ORF表达系统包括三个相关产品：ORF穿梭 载体系统，pAD-ORF腺病毒载体和预制 ORF AD-腺病毒。ORF 穿梭载体系统

上图为pENTER穿梭载体（维真生物），该载体与其他载体，如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒 和 shRNA载体 完全兼容。穿梭质粒中的ORF可以通过限制性内切酶简单的\"剪切和粘贴”转移至所有目标载体和病毒载体。两 组限制性内切酶 AsiSI/MluI (96%) 和 AsiSI/RsrII (99%) 可涵盖人类基因ORF 的99.5％。其他的人类基因ORF，可由其他限制性内切酶组合, 如AsiSI/NotI, AscI/RsrII 转移。ORF在CMV启动子启动下表达，在ORF的C\"端融合了Flag和 His标签，并具有SV40 poly（A）加尾信号。 pEnter载体含有SV40启动子启 动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转株的筛选。pEnter载体还含 有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将ORF序列同 源重组到腺病毒载体。pAD-ORF腺病毒载体

双筛选标签腺病毒载体（维真生物）pAD-ORF腺病毒载体是基于ORF基因表达系统的腺病毒质粒。通过在大肠杆菌中同源重组，将ORF基因序列从pEnter和除慢病毒、腺相关病毒之外 的大部分的目标载体转移至pAD腺病毒载体。pAD是最常用的人类腺病毒载 体 ， 是 E1 和 E3 基 因 缺 失 的 人 类 血 清 5 型 腺 病 毒 。 pAD-ORF 载 体 可 用 于 在HEK293细胞中包装重组腺病毒。维真生物为客户提供了两种pAD载体。pAD-Amp具有氨苄青霉素筛选标签，可用于与pEnter载体同源重组。另外，pAD- Kan具有的卡那霉素选择标签，也用于与其他目的载体重组。预制 ORF AD-腺病毒预制 ORF AD-腺病毒是一种预制的重组腺病毒。该腺病毒是通过携带 ORF的pEnter载体和pAD载体同源重组产生的。表达的ORF C\"末端融合了Flag和His标签。 维真生物的预制ORF AD-Adenovirus能够最有效的传递ORF基因， 可应用于对ORF基因体外和体内的功能研究。 注：更多腺病毒载体信息可登陆www.vigenebio.cn网站查看或咨询维真生物技术支持。二、操作步骤（一）腺病毒安全操作规范1．使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。2. 请在 BL2 生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。3. 请务必穿着实验服，佩戴一次性口罩和手套。4. 小心操作，避免产生气雾、飞溅或洒落。5. 被病毒污染的超净工作台，请立即用加入 1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭 干净；请务必将接触病毒的枪头、离心管、培养板、 培养液使用新配制的 10％漂白粉、84消毒液或 0.6%次氯酸钠溶液浸泡 1 小时以上再丢弃。6. 装盛腺病毒的实验用品需单独放置及培养，并加以标示。7. 用显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。观察完毕，请用70%乙醇 再次擦拭显微镜实验台。8. 离心病毒时，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后进行离心， 请尽量使用组织培养室内的离心机。9. 实验完毕脱掉手套后，请立即用肥皂和水清洗双手。10. 对共用实验室的人员需进行腺病毒安全培训或提示。（二）腺病毒感染目的细胞预实验不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议在正式实验前，在目 的细胞中进行预实验摸索最佳 MOI 值。为了节省病毒，推荐使用 96 孔板进行预实验。操作步骤如下：1. 第一天 细胞的准备将目的细胞接种于 96 孔板中，细胞融合率为 50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。2. 第二天 病毒的稀释取 10μL 腺病毒原液加入 90μL 培养液中做 1:100 稀释（10-2），以此为起 点做梯度稀释直至稀释 10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。3. 第二天 感染目的细胞取出提前准备好的 96 孔板，用准备好的病毒稀释液替代旧培养液，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。4. 第二至四天 观察荧光或检测腺病毒对细胞的感染较快，请在感染细胞后 12、24、36、48 小时分别观察 细胞中荧光表达情况（如果您选择的产品不带有荧光标签，请在 48、72、96、120 小时分别收获细胞并通过Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达）。注意事项：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，请务必保证加入 病毒前，细胞处于良好的生长状态。（三）Quantitative-PCR腺病毒滴度测定实时定量PCR法是一种简单的、高通量的测定病毒粗提裂解液和纯化病毒样本中腺病毒颗粒数量的方法。该方法用腺病毒基因组特异性引物进 行实时定量PCR。在定量曲线的线性范围内，Ct值与已知拷贝数质粒的Ct值的比值即为病毒基因组的初始拷贝数。1. 纯化腺病毒基因组DNA腺病毒颗粒基因组DNA外面包被有衣壳蛋白，使用蛋白酶K消化酶解病 毒衣壳。组成成分体积病毒液 5μl蛋白酶K (5μg/μl) 1μl超纯水 4μl1） 37 oC 孵育30 min。然后加热 95 oC 20 min 使酶失活；2）3000g 离心10 min，取上清冻存。2. QPCR:1）维真生物使用的病毒标准品的滴度为 3.6X108 个/ml。梯度稀释标准品至滴 度为 3.6×102-3.6×108 ，并将超纯水作为阴性对照；2）配制PCR反应体系，每个样品20 μl体系；组成成分 体积2XSYBRGreen缓冲液10μl引物混合物1μl超纯水7μl病毒样品或标准品 2 μl(相当于加入1μl初始病毒样品)样品应按下表准备：

3）进行PCR反应；4）病毒颗粒数的计算：病毒颗粒数(个/ml) = 与标准品相对值×1000 。（四）腺病毒感染目的细胞进行腺病毒感染实验时可使用完全培养液（培养目的细胞用）稀释。培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响腺病毒的感染效率。以 24 孔培养板为例，进行 HEK293 细胞的感染实验操作步骤如下：注意事项：实验前请按照不同的 MOI 设置不同的感染孔，并根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量。1. 第一天 细胞的准备在 24 孔培养板接种若干孔，每个孔内接种 3-5×104 个 HEK 293 细胞，铺 板时细胞的融合率为 50%左右，每孔培养液体积为 300μL，进行病毒感染时细胞的融合率约为 70%左右。2.第二天 病毒的准备根据实验的实际情况和 MOI 值，用培养液准确稀释腺病毒原液。注意事项：可使用 PBS 缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。3. 第二天 感染目的细胞 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液， 混匀后放于二氧化碳 培养箱（37 ℃、5%CO2）孵育过夜。注意事项：1）感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，请务必保证加入病毒前， 细胞处于良好的生长状态。2）若病毒对目的细胞的感染效率较低，可通过提高 MOI值提高病毒的感染效率，也 可在培养液中加入助感染试剂 ADV-HR（详见附录1、附录 4、附录 5）来提高病毒的感染效率。4. 第二天 更换培养液病毒感染细胞 12 小时后，更换培养液。 注意事项：换液具体时间需视细胞状态而定。如果腺病毒对细胞有明显毒性作用，影 响细胞生长状态，最短可于加病毒 4 小时后更换新鲜培养液后继续培养。5. 第三天 感染效率检测感染 24 小时后，可利用倒置荧光显微镜观察病毒感染目的细胞的效率。 如选择的腺病毒载体不带有荧光标记，可以通过 Q-PCR(定量 PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。