1. 用 50 ml TNM-FH /10％ FBS 培养液在 500 ml 旋转培养瓶中培养 Sf 9 细胞，直到细胞密度达到约 1 × 105 细胞/ml（见昆虫细胞保存培养实验）。

2. 室温下以 1000 g 离心 10 min 回收细胞，弃去上清。加入 10～20 ml 新鲜的 TNM- FH/10％ FBS 培养液重悬细胞团块。加入感染复数（MOI）为 0.1～0.5 的病毒接种（见步骤 1.2）。

MOI 以 pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI （pfu/细胞）× [细胞数/毒种储液的滴度（pfu/ml）]

3. 将细胞重新放入旋转培养瓶中，用 TNM-FH/10％ FBS 培养液将体积加至 100 ml。27℃ 置搅拌台上以 60～80 r/min 恒速搅动，培养 3～4 天。周期性地取少量悬浮培养细胞在显微镜下观察细胞病变效应及包含体。

4. 当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时（通常是感染 4～5 天后），将细胞培养液移入灭菌试管中，4℃ 以 1000 g 离心 10 min， 将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取 1 ml 上清移至几个螺口冻存管中，置液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处 4℃ 短期保存。

病毒储液也可以由悬浮生长的昆虫细胞（Sf 9、Sf 21 和 HighFive）制备：用无血清或无蛋白质的昆虫培养基来培养昆虫细胞，在 100 ml 或 500 ml (只加至 250 ml）的旋转培养瓶中，直到细胞密度达到（1～2）×106 细胞/ml。病毒应以 0.1～0.5 的感染复数直接加到悬浮培养液中，培养细胞 4～5 天，按步骤 2.4 收获病毒。

1. 以 1.8×107 Sf 9 细胞/瓶的密度，将细胞接种于两个 150 mm 培养瓶，在含 10％ 胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH 中培养。27℃ 温育 1 h 使细胞贴壁。

2. 当细胞贴壁时，取适量的待接种的杆状病毒于 30 ml 新鲜的含 10％ 胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH，使感染复数（MOI）为 0.1～1。细胞贴壁后，移去培养液，每个培养瓶中各加入 15 ml 含有病毒的培养液。

MOI 以 pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI （pfu/细胞）× [细胞数/毒种储液的滴度（pfu/ml）]

3. 27℃ 温育数日。每天在倒置显微镜下观察感染迹象，如细胞病变效应（如果使用包含体阴性重组病毒），或包含体（如果使用野生型杆状病毒或包含体阳性重组病毒）。包含体具高折光性，带微黄的绿色晶体状，在光学显微镜下很容易发现。

4. 当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时（通常在感染后 4～5 天），将培养液移入灭菌试管中，4℃，1000 g 离心 10 min， 将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取 1 ml 上清移至几个螺口冻存管中，置于液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处 4℃ 短期保存。该步骤应可得到约 40 ml （1～3）× 108 pfu/ml 的病毒储液。

如果待扩增的病毒源自单个噬斑（见病毒储液滴度测定实验），将琼脂糖块置于一含 0.5 ml TNM-FH/10％ FBS 的小离心管中 4℃ 旋转过夜。再按步骤 1.1 感染 Sf 9 细胞：在 100 mm 培养皿中，用 2 × 106 细胞，27℃ 温育 1 h。加入 8 ml TNM-FH /10％ FBS 培养液，27℃ 温育 4 天。按步骤 1.4 收获病毒。噬斑法确定滴度（见病毒储液滴度测定实验）， 重复步骤 1.1～1.3，扩增病毒以获得高滴度的储液。如果昆虫细胞已适应无血清培养，病毒储液也可用无血清培养的昆虫细胞制备（见昆虫细胞保存培养实验）。用无血清培养液代替 TNM-FH/10％ FBS，按步骤 1.1～1.4 进行即可。

1. 用含 10％ 胎牛血清的 TNM-FH 培养液稀释处于对数生长期的 Sf 9 细胞至约 5 × 105 细胞/ml。在噬斑试验之前几小时，以两种不同的密度（2 × 106 和 1.5 × 106 细胞/ml）将细胞种于 60 mm 组织培养皿中。对病毒储液的每一稀释度均设复皿（二个组织培养皿），27℃ 培养。

2. 根据病毒储液的来源，用 TNM-FH /10％ FBS 培养液制成 5 ml 病毒储液的系列稀释液。

高滴度病毒储液：10-6、10-7、10-8 稀释

转染上清（野生型病毒环状 DNA）：10-4、10-5 和 10-6 稀释

转染上清（野生型病毒线性化 DNA）:10-1 和 10-2 稀释

单个噬斑：10-1、10-2 和 10-3 稀释

3. 用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞（步骤 1）中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加 1 ml 至各复皿中 27℃ 温育 1 h， 加入病毒时摇动培养皿以保证病毒能均匀感染细胞。

4. 温育 1 h 后，制备琼脂糖顶层覆盖物。

5. 用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液，加入 4 ml 琼脂糖覆盖物。让琼脂糖室温固化 10～20 min (让凝结的水滴散去）。用 Parafilm 膜分别封住每个平皿（以防干涸），27℃ 培养 6～8 天。

6. 在噬斑形成较好而且裸眼容易看出的培养皿上，计数每一稀释度形成的噬斑数，计算病毒滴度（pfu/ml）。在 10-7 稀释度的培养皿形成 10 个噬斑或在 10-8 稀释度的培养皿形成 1 个噬斑，病毒滴度计算为 108 pfu/ml。

7. 如果裸眼辨别噬斑时遇到困难，则用台盼蓝染色。制备台盼蓝覆盖物，倾覆 1 ml 至培养了 6～8 天噬斑形成较好的培养皿中。27℃ 过夜温育培养皿，让染料扩散进入死细胞，计数蓝色噬斑的数目并确定病毒滴度。（噬斑内的死细胞将吸收台盼蓝染料，噬斑周围的活细胞不会吸收台盼蓝染料。）

确定病毒滴度的另一方案是终点稀释法。采用这种方法，需制备一系列病毒稀释液，并以此感染微量滴定板中的细胞，然后记好每一孔是否存在病毒感染并确定 50％ 终点。然而用这种方法滴定重组病毒储液，得到的结果与噬斑试验相比较难解释。野生型病毒由于包含体的聚集很容易计数，而重组病毒则由于没有包含体有时难以计数。

1. 每一稀释度均设复皿是必需的，因为噬斑实验的结果有差异。通常测定 3 个不同稀释浓度的病毒所形成噬斑，共需要 12 块组织培养皿测定每种病毒储液的浓度（6 块培养皿以 1.5 × 106 细胞/ml 接种，6 块培养皿以 2 × 106 细胞/ml 接种）。

2. 做病毒噬斑试验时，细胞单层培养物的密度很关键。如果培养 5 天后，噬斑仍然太小，则细胞接种太密；如果噬斑太大和扩散，则细胞接种太稀。对特定细胞系，可用一系列不同的细胞密度通过噬斑实验确定其最佳噬斑细胞密度。

3. 如果重组病毒含有 lacZ 基因，如来自 pBlueBacIII (Invitrogen) 或 pAC360 β-Gal 的重组体，在琼脂糖固化前加入 150 μg/ml X-gal（来自 20 mg/ml 储存液，储存液由无菌的二甲基甲酰胺制备， -20℃ 可保存数月），重组体的噬斑因显示明亮的蓝色容易与非重组体辨别。

4. 步骤 5 中，若使用加湿的 27℃ 培养箱，培养皿无需用 Parafilm 膜封住。

5. 噬斑持续形成至 2 周。如果在 2 周时还看不到噬斑，可能由于细胞接种密度过高所致，应该以较低密度（在 1 × 105 和 1.3 × 106 细胞/平皿之间）重新接种。