客户单位：中国科学院生物物理所范祖森课题组                                             中康博提供：Affymetrix  mRNA+LncRNA二合一芯片检测 （筛选差异mRNA和lncRNA）             高通量生物信息分析（聚类分析、功能富集分析、KEGG信号通路富集分析）推荐语:  LncRNA介导的生物学已经牵涉于许多细胞过程。在癌症中，lncRNAs可作为转录调控因子与染色质重塑复合物（SWI / SNF复合物）协作发挥功能。SWI/ SNF复合物参与哺乳动物干细胞自我更新和分化过程。然而，肿瘤干细胞中SWI / SNF复合物功能是什么仍然不太清楚。中国科学院生物物理所的范祖森研究员带领的研究小组在国际学术期刊《Cell Stem Cell》上在线发表了一项名为< The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self-Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling >的最新研究论文，首次发现了一个新的非编码RNA—— lncTCF7, 它可以募集SWI / SNF复合物到TCF7的启动子区域来调节其表达，从而激活Wnt信号通路，进一步促进肝癌干细胞的自我更新。研究示意图：  研究新颖点：1. 长链非编码RNA——lncTCF7在肝癌组织和肝癌干细胞（CSCs）中高表达。2. LncTCF7对肝脏CSCs的自我更新至关重要。3. LncTCF7通过调控TCF7的表达激活Wnt信号通路。4. LncTCF7招募SWI / SNF复合体激活TCF7启动子。研究思路：  研究结果：1. 肝癌干细胞的筛选（样品筛选）   CD13和CD133已被广泛用作肝CSC表面标记。根据标志物，将Hep3B/Huh7和PLC / PRF的HCC细胞系分别分成CD13+ CD133+细胞和CD13-CD133-细胞。研究发现：相比于CD13-CD133-细胞，CD13+ CD133+细胞的致瘤能力更强。   2. lncTCF7在肝癌干细胞中高表达（高通量筛选+ 验证）       为鉴定肝癌CSCs 的lncRNAs，采用来自3种细胞系的CD13+CD133+细胞（肿瘤干细胞）和CD13-CD133-细胞（非肿瘤干细胞）进行lncRNA芯片检测（Affymetrix）, 分析结果发现286个差异的lncRNA，随机选择10个lncRNAs进行PCR验证。研究选择了一个未鉴定的基因间lncRNA（命名为lncTCF7），由三个外显子组成，跨越将近3.6kb个碱基。研究者选择这个lncRNA出于以下三点考虑：1.     LncTCF7在肝脏的CSCs高表达。2.     位于HSPA4和TCF7基因之间。3.     位于细胞转录因子或干细胞信号通路相关基因附近。       接下来， 在37配对的HCC肿瘤和癌旁组织、14例乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝肝硬化组织以及8例正常肝组织中验证lncTCF7的表达。结果发现：lncTCF7在HCC肿瘤中和肝癌细胞系中显著高表达，而在肝硬化样品和健康肝组织中几乎检测不到，这表明lncTCF7表达具体疾病特异性。研究进一步通过Northern、RACE、RNA-FISH和细胞分级分离测定等实验确定lncTCF7是一个长度为683nt、位于细胞核的在肝癌干细胞中高表达的长链非编码RNA。   3. lncTCF7维持肝癌干细胞的自我更新（功能研究）       为了研究lncTCF7在肝癌干细胞的自我更新作用， 研究构建了lncTCF7细胞突变株。lncTCF7的敲降后转录因子Sox2，Nanog和Oct4的表达显著下调，并且显著抑制肝癌干细胞的致瘤成型能力。接下来，为进一步验证所得结果，构建了lncTCF7过表达细胞系。LncTCF7过表达显着上调转录因子的表达，也显著增强肿瘤干细胞致瘤成型能力。这些数据表明，lncTCF7在肝癌干细胞的自我更新维护中起关键作用。  4. lncTCF7激活TCF7的表达从而活化Wnt通路（lncTCF7的靶基因及通路研究）         为了进一步探索lncTCF7的靶基因， 研究采用对照组+lncTCF7敲降组的分组方式，收集细胞样品进行表达谱芯片检测，发现了2491个差异基因，其中就包括它的临近基因TCF7(HSPA4，另一个邻近基因显示任何显著改变)。接下来对差异基因进行功能通路富集分析，发现这些差异基因涉及很多重要的信号通路，特别是Wnt信号通路（Wnt通路的相关基因）。后又通过在HCC细胞系（Hep3B/Huh7/PLC）和肝癌原代细胞中进一步验证TCF7和主要Wnt靶基因的表达水平。此外，lncTCF7过表达会显着增强TCF7和主要Wnt基因的表达。这些数据初步确定lncTCF7的靶基因——TCF7和Wnt相关基因。接下来，构建TCF7敲降细胞系。TCF7敲降后抑制Sox2的表达，且显著抑制肝癌干细胞的自我更新和致瘤成形能力。         TCF7位于lncTCF7附近，两者又存在表达差异，很符合顺式调控的类型。研究者收集了30例肝癌患者样品进行PCR检测, 发现lncTCF7与TCF7在表达值上呈正相关。          接下来，要进一步确定TCF7是否在lncTCF7的下游发挥自我更新作用，研究在lncTCF7敲降细胞中导入重组TCF7质粒， 发现TCF7恢复了肝癌干细胞的致瘤成形力和增殖力。 LncTCF7敲降后会显著下调部分Wnt分子，包括Wnt7a、Wnt4和Wnt2b等。在这3种Wnt信号分子， Wnt7a的表达量下调最为显著。        为了进一步确定Wnt7a是否在lncTCF7和TCF7的下游发挥作用， 研究在lncTCF7敲降细胞中导入重组Wnt7a质粒，发现Wnt7a能恢复肝癌干细胞中TCF7、Sox2和Nanog的表达水平，也能恢复肝癌干细胞的致瘤成形力。 DKK1是Wnt信号通路的胞外抑制剂。DKK1的处理封闭了肝癌干细胞中lncTCF7维持的自我更新能力。这些数据表明，lncTCF7 在 TCF7的上游调控肝癌干细胞的自我更新能力。总之，lncTCF7促进TCF7表达来激活Wnt信号通路，导致肝CSC的自我更新。   5. lncTCF7募集SWI/SNF复合物激活TCF7从而活化Wnt信号（lncTCF7/蛋白/TCF7间的分子机制）         LncRNA通常与蛋白相互作用来发挥其调控功能。研究采用RNA pull-down实验来寻找潜在lncTCF7的结合蛋白。 BRG1、BAF170和SNF5构成的SWI / SNF复合物，被鉴定为lncTCF7的结合蛋白，并通过RNA免疫沉淀（RIP）进一步验证。lncTCF7敲降后并不影响BAF170、BRG1和SNF5的表达水平，这表明lncTCF7没有参与SWI / SNF复合物的翻译后调节。接下来，构建一系列lncTCF7截短体，与SWI / SNF复合物进行结合实验。结果发现: lncTCF7的468—683 nt序列是BAF170、BRG1和SNF5的结合位点，并经EMSA进一步证实。这些数据表明，lncTCF7以高亲和力结合到SWI/ SNF复合物上。            接下来，通过荧光素酶报告确定了TCF7的-1,200到-1,100 nt是 BAF170的结合位点。并通过DNA酶I消化测定实验和CHIP实验进一步验证。这些数据表明，lncTCF7募集SWI / SNF复合物的TCF7启动子，从而导致其活化。          SWI / SNF复合物在HCC肿瘤和肝脏的CSCs中高表达，这表明SWI / SNF复合物可能参与CSC自我更新。BAF170敲降后显着下调TCF7、Nanog及Wnt信号的下游靶基因如Sox2的，CCND1和CCND2的表达。同时，BAF170敲降后显著降低肝癌干细胞的致瘤成形力和增殖能力。SNF5和BRG1呈现类似的结果。总之，数据表明：lncTCF7募集SWI/SNF复合物激活TCF7从而活化Wnt信号发挥自我更新调控作用 。   研究结论：       在这项研究中，定义一个新lncRNA（命名为lncTCF7），对肝癌干细胞的自我更新至关重要。lncTCF7通过招募SWI / SNF复合物顺式激活TCF7的表达，而TCF7的表达又活化了Wnt信号通路。Wnt信号通路在肝癌干细胞的自我更新和分化中发挥重要作用。 总之，lncTCF7可以通过招募SWI/ SNF复合物激活TCF7从而活化 Wnt信号通路发挥自我更新调控作用。 PS: 文章中涉及的基因芯片检测和数据分析由本公司完成！参考文献：The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self-Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling    北京中康博生物科技有限公司（beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD）是北方乃至全国最大的Affymetrix检测中心之一，公司以数据分析为特色，整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代测序、个性化生物信息分析三项核心服务。立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学工作者提供分子生物学高端技术服务。