原标题：抗CD19的构建和临床前评估 本文献阐述了构建CD19 二代和三代CAR ，逆转录病毒包装，PG13 产毒株构建，T 细胞培养，逆转录病毒感染T 细胞，快速扩增CART ，CART 检测及功能实验（ELISA 、胞内因子染色、杀伤实验）等流程。 介绍 在美国，每年约有2.2 万人死于B 细胞恶性肿瘤[1] 。一些B 细胞恶性肿瘤，包括套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病（CLL ），无法通过常规化学疗法和单克隆抗体[2] 的疗法治愈[3] 。但是某些患有这些疾病的患者在异体干细胞移植后可以实现更长的无病生存期[4-6] 。不幸的是，同种异体干细胞移植受到与移植相关的重大死亡率和合适的供体短缺的限制[2,6,7] 。在异基因干细胞移植后复发的B 细胞恶性肿瘤患者中，输注同种异体供体淋巴细胞可诱导缓解[8-10] 。这些淋巴细胞输注的有效性为尝试开发针对B 细胞恶性肿瘤的其他细胞免疫疗法提供了理论依据。 从肿瘤浸润性淋巴细胞培养的自体T 细胞的过继转移可能导致人类[11,12] 晚期黑素瘤的消退。因为肿瘤反应性T 细胞由于不能从大多数人类肿瘤中可靠地培养出来，因此已经开发出了一些方法来改造T 细胞，使其表达编码肿瘤抗原特异性T 细胞受体的基因[13,14] 。这些遗传修饰的T 细胞的过继转移是癌症免疫疗法[15] 的一种有前途的方法。过继T 细胞疗法的另一种方法是改造T 细胞以表达嵌合抗原受体（CARs ）[16,17] 。CAR T 由偶联了抗原的受体组成信号分子可以激活表达CAR [18-20] 的T 细胞。最通常掺入CAR 的抗原受体是单链可变区部分（scFv ），由通过肽接头连接的单克隆抗体的轻链和重链可变区组成。鼠模型显示，用编码CARs 的逆转录病毒转导的T 细胞可以保护小鼠免受体内肿瘤的侵害[21,22] 。 我们的小组已经完成了一项I 期临床试验，在该试验中，卵巢癌患者接受了T 细胞的治疗，该细胞转导了针对卵巢癌相关抗原α叶酸受体[23] 的CAR 。没有观察到客观的肿瘤消退。该临床试验中使用的CAR 掺入了Fc 受体- γ胞质信号链，而没有任何共刺激分子，例如CD28 或4-1BB 。小鼠中的最新研究表明，含有TCR- ζ细胞质信号链的CAR 比含有Fc 受体- γ细胞质信号链的CAR 具有更好的体外功能和体内抗肿瘤功效[24] 。细胞和鼠的体内研究表明，将CD28 的信号传导域掺入CARs 可增强功能和体内抗肿瘤功效[22,25-27] 。已显示4-1BB 共刺激分子的信号增强T 细胞增殖和持久性[28,29] ，而4-1BB 信号增强体外CARs 的功能[30,31] 。因此，自从我们上次使用CAR 转导的T 细胞进行临床试验以来，CAR 设计取得了重大进展。 D19 是抗原特异性T 细胞疗法的有希望的靶标，因为CD19 在大多数恶性B 细胞[32,33] 上表达，唯一表达CD19 的正常细胞是B 细胞，也许是滤泡树突状细胞[33,34] 。重要的是，CD19 在多能造血干细胞[35] 上不表达。正常B 细胞的破坏是靶向CD19 的一个缺点，但对正常B 细胞的破坏却具有良好的耐受性。在大多数接受广泛使用的抗CD20 单克隆抗体利妥昔单抗的患者中，正常外周血B 细胞的数目在数月内严重降低[36] ，但与化疗药物相比，接受化疗加利妥昔单抗的患者的感染率没有增加。接受单独进行化学疗法[37] 。最后，如果需要增加IgG 水平，可以静脉注射IgG 治疗患者[38] 。 材料和方法 MSGV-FMC63-28Z和MSGV-FMC63-CD828BBZ重组逆转录病毒载体的构建 MSGV-FMC63-28Z 重组逆转录病毒载体编码MSGV （基于小鼠干细胞病毒的剪接gag 载体）逆转录病毒骨架和FMC63-28Z CAR 。FMC63-28Z CAR 由源自FMC63 小鼠的抗CD19 scFv 组成杂交瘤[39] ，人CD28 分子的一部分以及人TCR- ζ分子的细胞内成分。FMC63-28Z CAR 中包含的CD28 分子的确切序列对应于Genbank 标识符NM_006139 。该序列包括所有从氨基酸序列IEVMYPPY 开始并一直延伸到蛋白质羧基末端的氨基酸。要编码载体的抗CD19 scFv 成分，我们设计了一种基于先前发表的CAR [40] 的DNA 序列。该序列在5\' 端至3\' 端的框架内编码以下成分：XhoI 位点，人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF ）受体α链信号序列，FMC63 轻链可变区[39] ，接头肽[40] ，FMC63 重链可变区[39] 和NotI 位点。该序列由GeneArt AG （德国雷根斯堡）合成，并且用XhoI 和NotI （New EnglandBiolabs ）消化编码该序列的质粒。为了形成MSGV-FMC63-28Z 逆转录病毒载体，将编码FMC63 scFv 的XhoI 和NotI 消化的片段连接到第二个XhoI 中和NotI 消化的片段，其编码MSGV 逆转录病毒骨架[14] 以及人CD28 的细胞外部分的一部分，人CD28 的整个跨膜和细胞质部分，以及人TCR- ζ分子[41] 的细胞质部分。 我们还设计了第二个重组逆转录病毒载体，称为MSGV-FMC63-CD828BBZ ，该载体由5\' 到3\' 依次包含以下成分：MSGV 逆转录病毒骨架，FMC63 scFv ，CD8 分子的铰链和跨膜区域，细胞质CD28 和4-1BB 的部分，以及TCR- ζ分子的胞质成分。MSGVFMC63-CD828BBZ 使用多步策略构建。片段编码CD8 ，CD28 、4-1BB 和TCR- ζ组分是使用以下引物通过重叠PCR 方法[42] 生成的： NotI-CD8F: 5 ′-acgGCGGCCGCAttcgtgccggtcttcctgc-3 ′;28cyto-CD8R: 5 ′- gcctgctcctcttactcctgttcctgtggttgcagtaaag-3 ′;CD8-28cytoF: 5 ′- ctttactgcaaccacaggaacaggagtaagaggagcaggc-3 ′;BamHI-zetaR: 5 ′- ttat GGATCC ttagcgagggggcagggcc-3 ′.使用人CD8 αcDNA 作为模板，使用NotI-CD8F 和28cyto-CD8R 寡核苷酸引物来生成PCR 产物，该产物编码CD8 的铰链和跨膜区域。使用正向引物CD8-28cytoF 和BamHI-zetaR 反向引物产生以CD28-4-1BB-CD3 ζ的顺序编码CD28 、4-1BB 和TCR- ζ组分的胞质部分的重叠片段。合并两个PCR 产物，并使用NotI-CD8F 和BamHI-zetaR 引物产生全长构建体。将编码该全长构建体的DNA 和编码FMC63 scFv 的DNA 连接到MSGV 逆转录病毒骨架中，以形成MSGV-FMC63-CD828BBZ 逆转录病毒载体。 培养基 T 细胞始终在由AIMV 培养基和5 ％AB 血清（GeminiBioproducts ，Woodland ， CA ），100 U/ mL 青霉素，100μg/mL 链霉素和1.25μg/mL 两性霉素B 组成的T 细胞培养基中培养。培养基由Roswell Park Memorial Institute （RPMI ）1640 加上10 ％胎牛血清（FBS ），100U/ mL 青霉素，100μg/ mL 链霉素和2 mM L- 谷氨酰胺组成。D10 培养基由Dubecco 改良的Eagle 培养基，10 ％FBS ，100 U / mL 青霉素，100μg/mL 链霉素，非必需氨基酸组成酸和2 mM L- 谷氨酰胺。SupB15 培养基由Iscove 的改良Dulbecco 培养基加20 ％FBS ，100 U/ mL 青霉素，100μg/ mL 链霉素，2 mM L- 谷氨酰胺和0.055 mM 2- 巯基乙醇组成。细胞毒性培养基为无酚红RPMI 加5 ％AB 血清（Gemini Bioproducts ），100 U/ mL 青霉素和100μg/ mL 链霉素。除AB 血清外，所有细胞培养基成分均来自Invitrogen （加利福尼亚州卡尔斯巴德）。重组人IL-2 获自Chiron （Emeryville ，CA ）。 瞬时逆转录病毒的生产 为了瞬时产生逆转录病毒，使用Lipofectamine2000 （Invitrogen ）。将转染的细胞在不含抗生素的D10 培养基中于37℃ 孵育6-8 小时。然后将用于转染的培养基替换为新鲜的D10 培养基，并将细胞再孵育36-48 小时。转染过程中和转染后，将293GP 细胞培养在聚D- 赖氨酸包被的培养皿（BD Biosciences ，加利福尼亚州圣何塞）上。从培养皿中除去含有上清液的逆转录病毒，并离心除去细胞碎片。将上清液在干冰上速冻并在-80℃ 下保存。瞬时产生的逆转录病毒用于图1 和2 以及表1 中所述的实验中。此外，所有编码SP6-28ZCAR 的逆转录病毒都是瞬时产生的。 MSGV-FMC63-28ZPG13 生产细胞克隆H3 的生成 PG13 包装细胞克隆是使用PG13 长臂猿猿猴白血病病毒包装细胞系（ATCC ，Manassass ，VA ）和人类嗜生性包装细胞系PhoenixPhoenix （由加利·诺兰（Gary Nolan ），斯坦福大学，斯坦福大学提供）产生的。所有细胞在不含抗生素的D10 培养基中培养。将细胞保持在37℃ 和5 ％CO2 下。 PG13 逆转录病毒生产细胞克隆如前所述[14] 产生，但有以下变化。使用Lipofectamine2000 转染试剂（Invitrogen ），用9 μg 质粒DNA （MSGVFMC63-28 ）转染Phoenix ECO 细胞。48 小时后，收集上清液并用于转导逆转录病毒包装细胞系PG13 。非组织培养物处理的6 孔板涂有20 μg/ml 重组纤连蛋白片段（RetroNectin ™），如制造商（Takara USA ，麦迪逊，威斯康星州）所述。向每个孔中加入逆转录病毒载体上清液（4ml ），然后在32℃ 下离心（2000 ×g ）3 小时。离心后，除去上清液，并分离5 ×10 5 PG13 细胞将其加入到每个孔中，并将板在32 ℃下离心（1000 ×g ）10 分钟。第二天重复转导，然后通过有限稀释克隆产生PG13 生产细胞克隆。由于缺乏选择标记，因此鉴定出高滴度的克隆如先前所述，通过RNA 斑点印迹[14 ，46] 。从6 个最高滴度的克隆产生逆转录病毒上清液。简要地，以4 ×10 4 个细胞/cm 2 接种175cm 2 的组织培养瓶（Nunc ，Cole-Parmer ，Vernon Hills ，IL ）。在第3 天进行培养基交换（30ml ）。24 小时后收获上清液，并等分。将上清液储存在-80 ℃直至进一步使用。通过如下文\"逆转录病毒转导”中所述转导T 细胞并如下文\"转导T 细胞上的CAR 检测”中所述测量转导T 细胞表面上的CAR 表达来评估来自每个克隆的上清液。在酶联免疫吸附（ELISA ）分析中测量了转导的T 细胞以CD19 特异性方式产生干扰素γ（IFN γ）的能力。选择一个命名为H3 的克隆用于生产主细胞库，并随后在良好生产规范（GMP ）条件下生产逆转录病毒上清液。 在良好生产规范（GMP ）条件下使用PG13 生产细胞克隆H3 生产MSGV-FMC63-28Z 逆转录病毒 在第0 天，在200mL D10 培养基中以4 ×10 4 克隆H3 细胞/cm 2 的细胞密度总共接种了26 个1700cm 2 的膨胀表面滚瓶。在第3 天，更换培养基并用120mL D10 培养基替换。每天收获含有逆转录病毒载体的培养基，并用120 mL 培养基重新装瓶。每天使用罗氏（Roche ）的Accu-check 系统（瑞士罗莎（Basal ）的Accu-check ）监测血糖水平。如果葡萄糖水平降至2g/l 以下，则所有后续收获的培养基交换量将增加一倍，达到240 ml/ 滚筒瓶。将所有收获物等分并储存在-80 ℃下直至进一步使用。所有临床产品均按照当前的监管指南47-50 进行了广泛的生物安全测试程序。 患者样本和细胞系 非白血病PBMC 样本是从黑色素瘤患者中获得的，这些患者已通过美国国家癌症研究所（NCI ）外科分会的机构审查委员会批准的方案参加。白血病PBMC 获自NCI 方案编号1997-C-0178 的慢性淋巴细胞性白血病（CLL ）患者。将PBMC 冷冻保存在90 ％FBS 和10 ％DMSO （Sigma ，St.Louis ，MO ）中。使用了以下表达CD19 的永生细胞系：bv173 （淋巴样样慢性骨髓性白血病）爆炸危机，由美国马里兰州贝塞斯达的A. Wiestner 国家心脏肺部血液研究所赠送的，NALM-6 （来自德国不伦瑞克的DSMZ 的急性淋巴性白血病），SupB15 （来自ATCC ，Manassass ，VA 的急性淋巴性白血病）），托莱多（B 细胞弥漫性大细胞来自ATCC 的淋巴瘤）。使用了以下CD19 阴性细胞系：A549 （肺癌，来自ATCC ），CCRF-CEM （白血病，来自ATCC ），K562 （慢性粒细胞白血病，来自ATCC ），MDA231 （乳腺癌来自ATCC ），TC71 （尤因氏肉瘤，是美国国家癌症研究所M. Tsokos 博士的礼物，编号：624 （黑色素瘤，来源于国家癌症研究所外科科）。除SupB15 外，所有细胞系均维持在R10 培养基中。SupB15 在SupB15 培养基中培养。当将CLL PBMC 用作测定中的靶标时，在测定前将细胞在R10 培养基中培养12-18 小时。 T 细胞培养 解冻外周血单个核细胞（PBMC ）并在T 细胞培养基中洗涤一次。将PBMC 以每毫升1 ×10 6 细胞的浓度悬浮在含有50 ng/mL 抗CD3 单克隆抗体OKT3 （Ortho ，Bridgewater ，NJ ）和300 IU/ml 的T 细胞培养基中毫升的IL-2 。将20mL 该悬浮液加入到75cm 2 培养瓶（Corning ，Corning ，NY ）中。将烧瓶在37 ℃和5 ％CO 2 下直立培养。将OKT3 直接添加到培养基中的这种T 细胞刺激方法称为溶解性OKT3 ，在本文报道的所有实验中均用于PBMC 的初始刺激，除了图6 和表3 中报道的结果的患者1-3 。 在一些实验中，使用了来自CLL 患者的白血病PBMC 样品。这些白血病PBMC 有时包含大量CD19 + 白血病细胞。在这些情况下（图6 和表3 中的患者1-3 中所示的实验），根据制造商的说明，使用CD19 微珠和LD 柱（Miltenyi ，Auburn ，CA ）从PBMC 中去除了CD19 + 细胞。当CD19 + 细胞耗尽时，通过将CD19 耗尽的PBMC 添加到用OKT3 包被的平板上来启动T 细胞培养。OKT3 在PBS 中稀释至10 μg/ mL 的浓度。将1mL 的该OKT3 溶液添加至24 孔板（Corning ）的每个孔中。将板在室温下孵育4 小时，然后用PBS 洗涤一次。接下来，将耗尽CD19 的PBMC 以每毫升1 ×10 6 个细胞的量悬浮在T 细胞培养基中，加300 IU/mL 的IL-2 ，并将1 mL 的该溶液添加到OKT3 包被板的每个孔中。 逆转录病毒转导 将RetroNectin ™（Takara ）以15 μg/mL 的浓度溶解在PBS 中，并将2mL 的RetroNectin ™的PBS 溶液添加到非组织培养包被的6 孔板（BD Biosciences ）的每个孔中。将板在室温（RT ）下孵育2 小时。孵育后，吸出RetroNectin ™溶液，并将2 mL 含汉克斯平衡盐溶液（HBSS ）和2 ％牛血清白蛋白（BSA ）的封闭溶液添加到每个RetroNectin ™包被的孔中。将板在RT 温育30 分钟。吸出封闭液，并用HBSS + 2.5 ％HEPES 溶液冲洗孔。将逆转录病毒上清液快速融化，并在T 细胞培养基中以1 ：1 稀释。当使用瞬时产生的逆转录病毒上清液时，然后将2 mL 稀释的上清液添加到每个RetroNectin ™包被的孔中。当使用来自H3 生产细胞克隆的上清液时，将4 mL 1 ：1 稀释的上清液添加到每个孔中。添加上清液后，将板在32 ℃以2000 ×g 离心2 小时。上清液是然后从孔中吸出，并向每个孔中添加已用OKT3 和IL-2 培养2 天的2 ×10 6 T 细胞。当将T 细胞添加到逆转录病毒包被的板中时，将它们以0.5 ×10 6 个细胞/ mL 的浓度悬浮在T 细胞培养基中加上300IU/mL 的IL-2 。将T 细胞添加至每个孔后，将板以1000 ×g 离心10 分钟。将板在37 ℃下孵育过夜。 第二天重复转导。用RetroNectin ™包被新的6 孔非组织培养物包被的板（BD Biosciences ），并以与第一次转导相同的方式封闭。将逆转录病毒上清液添加到每个孔中，并将板与第一次转导相同地离心。然后将来自第一次转导的T 细胞转移到新的逆转录病毒包被的平板上，并将平板以1000xg 离心10 分钟。孵育20 小时后，将T 细胞从平板上移出，并悬浮在新鲜的T 细胞培养基中，该培养基中含有浓度为0.5 ×10 6 个细胞/ mL 的300 IU/mL IL-2 ，并在37 ℃和5 ％CO2 下培养。 快速扩增方案（REP ） 为了产生大量转导的T 细胞，使用快速扩增方案（REP ）[11,51] 诱导细胞增殖。在用于REPs 之前，T 细胞已开始与OKT3 和IL-2 一起培养，并在开始培养后的第二天和第三天进行了转导，如上所述。培养开始后十天，将0.5 ×10 6 转导的T 细胞与100 ×10 6 同种异体，辐射（5000 rad ）的PBMC 合并，并将这些细胞悬浮于35 mL 的T 细胞培养基中，其中含有30 ng/mL 的OKT3 和300 IU/mL 的IL-2 。将细胞在75cm 2 烧瓶中在37 ℃和5 ％CO 2 下培养。五天后，对细胞计数并以0.5 ×10 6 细胞/mL 的浓度悬浮在具有300IU/mL IL-2 的新鲜T 细胞培养基中。在剩余的培养时间内，每两天对细胞计数并以0.5 ×10 6 细胞/ mL 的浓度悬浮在新鲜T 细胞培养基中，每两天含300 IU/mL IL-2 。 转导T 细胞的CAR 检测 洗涤细胞并将其悬浮在FAC 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS ）加0.1 ％叠氮化钠和0.4 ％BSA ）中。Fc 受体被正常山羊IgG （Invitrogen ）阻断。对于每个要分析的T 细胞培养物，准备了两管细胞。将生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F （ab ）2 抗体（anti-Fab ，JacksonImmunoresearch ，West Grove ，PA ）添加到一个试管中以检测FMC63 scFv ，然后用生物素标记的正常多克隆山羊IgG 抗体（Jackson 将Immunoresearch ）添加到另一管中以用作同种型对照。将细胞在4 ℃温育25 分钟并洗涤一次。将细胞悬浮在FACs 缓冲液中，并用正常小鼠IgG （Invitrogen ）封闭。然后将细胞用藻红蛋白（PE ）标记的链霉亲和素（BD Pharmingen ，加利福尼亚州圣地亚哥市）和别藻蓝蛋白（APC ）标记的CD3 （eBiocience ，加利福尼亚州圣地亚哥市）。用BD FacsCantoII （BD Biosciences ）进行流式细胞仪采集，并用FlowJo （Treestar ，Inc. Ashland ，OR ）进行分析。 干扰素- γ酶联免疫吸附测定（ELISA ） 洗涤靶细胞，以每毫升1 ×10 6 个细胞的量悬浮在不含IL-2 的T 细胞培养基中。将每种靶细胞类型的十万个靶细胞添加到96 孔圆形底板（Corning ）的两个孔中的每个孔中。洗涤效应T 细胞培养物，并以每毫升1 ×106 个细胞的浓度悬浮在不含IL-2 的T 细胞培养基中。在96 孔板的指定孔中，将十万个效应T 细胞与靶细胞结合。另外，制备仅含有T 细胞的孔。将板在37 ℃下孵育18-20 小时。温育后，使用标准方法（Pierce ，Rockford ，IL ）进行IFN γELISA 测定。 细胞内细胞因子染色测定法（ICCS ） CD19-K562 和NGFR-K562 细胞用作ICCS 分析的靶标。对于每个测试的T 细胞培养物，准备两个试管。一个试管中包含0.5 ×106 个CD19-K562 细胞，另一管中包含0.5 ×10 6 个NGFR-K562 细胞。两管均含0.5 ×10 6 T 细胞，1 ml 不含IL-2 的T 细胞培养基和1 μL 高尔基体（BD Pharmingen ）。将所有试管在37 ℃下孵育5 小时，然后转移至4 ℃下过夜。第二天早晨，洗涤细胞并用以下抗体进行表面染色：CD3 （eBioscience ，克隆UCHT1 ），CD4 （eBioscience ，克隆OKT4 ）和CD8 （eBioscience ，克隆RPA-T8 ）。根据Cytofix /Cytoperm 试剂盒（BD Pharmingen ）的说明，对细胞进行透化，并对IFN γ（BD Pharmingen ，克隆B27 ）和IL-2 （BD Pharmingen ，克隆MQ1-17H12 ）进行细胞内染色。用BD FacsCantoII （BD Biosciences ）进行流式细胞仪采集，用FlowJo （Treestar ）进行分析。 细胞毒性测定 我们使用流式细胞仪细胞毒性试验[52] 的略微修改版本。在该试验中，通过比较靶细胞的存活率与阴性对照细胞的存活率来测量靶细胞的细胞毒性。阴性对照细胞和靶细胞与效应T 细胞合并在同一管中。在我们的实验中，目标细胞是来自CLL 患者的未操纵的PBMC ，该细胞由大于55 ％的B 细胞组成，阴性对照细胞是CCRF-CEM 细胞。 将CCRF-CEM 细胞以1.5 ×106 细胞/ mL 的浓度悬浮在R10 培养基中，并将荧光染料5- （and-6 ）- （（（（4- 氯甲基）苯甲酰基）氨基）四甲基罗丹明（CMTMR ）（Invitrogen ）加入浓度为5 μM 。混合细胞，然后在37 ℃下孵育30 分钟。然后洗涤细胞并将其悬浮在细胞毒性培养基中。接下来，将CCRF-CEM 细胞在37 ℃下孵育60 分钟。然后将细胞洗涤两次并悬浮在细胞毒性培养基中。 将CLL PBMC 以1 ×10 6 个细胞/ mL 的浓度悬浮于PBS + 0.1 ％BSA 中。向该细胞悬液中加入浓度为1 μM 的荧光染料羧乙酸二乙酸丁二酯琥珀酰亚胺酯（CFSE ）（Invitrogen ）。将细胞在37 ℃温育10 分钟。孵育后，通过添加等于细胞悬浮液体积的FBS 终止标记反应，并将细胞在室温孵育2 分钟。洗涤细胞并将其悬浮在细胞毒性培养基中。 洗涤效应T 细胞并将其以5 ×10 6 细胞/ mL 悬浮在细胞毒性培养基中。在所有实验中，将用抗CD19 CARFMC63-28Z 转导的效应T 细胞的细胞毒性与同一患者经SP6-28Z 对照CAR 转导或未转导的阴性对照效应T 细胞的细胞毒性进行了比较。转导。对于FMC63-28Z 转导的效应T 细胞和阴性对照效应T 细胞，将培养物一式两份在无菌5 mL 试管（BD Biosciences ）中以下T 细胞：靶细胞比例：10 ：1 、3 ：1 ，和1 ：1 。来自CLL 患者的靶细胞始终为50,000 PBMC 。每种培养物还包含50,000 个CCRL-CEM 阴性对照细胞。另外，建立仅包含CLL 靶细胞和CCRL-CEM 阴性对照细胞的试管。将培养物在37 ℃下孵育4 小时。孵育后，立即按照制造商的建议添加7AAD （7- 氨基放线菌素D ）（BD Pharmingen ），并使用BD FacsCantoII （BD Biosciences ）进行流式细胞仪采集。使用FlowJo （Treestar ，Inc. Ashland ，OR ）进行分析。对7AAD 阴性（活）细胞进行门控分析，并为每种T 细胞+ 靶细胞培养确定了活CLL 靶细胞和活CCRF-CEM 阴性对照细胞的百分比。对于每种T 细胞+ 靶细胞培养物，CLL PBMC 的存活百分数通过将活CLL PBMC 百分数除以活CCRF-CEM 阴性对照细胞百分数来确定。校正后的CLL 生存率通过将每种T 细胞+ 靶细胞培养物中CLL PBMC 的存活百分比除以仅包含CLL 靶细胞和CCRF-CEM 阴性对照细胞的试管中的CLL 靶细胞百分比：CCRF-CEM 阴性对照细胞百分比的比率来计算PBMC 没有任何效应T 细胞。这种校正对于考虑起始细胞数量的变化和自发靶细胞死亡是必要的。将细胞毒性计算为CLL PBMC 的细胞毒性百分比= 100 校正的CLL PBMC 的存活百分比。对于所有效应子：靶标比率，一式两份确定细胞毒性并将结果平均。 结果 我们比较了两个含有FMC63 杂交瘤[39] 衍生的小鼠抗人CD19 scFv 的FMC63-28Z 和FMC63-CD828BBZ 。MSGV-FMC63-28Z 逆转录病毒载体编码FMC63 scFv ，CD28 共刺激分子的一部分，TCR- ζ分子的胞质成分和MSGV 逆转录病毒骨架（图1A ）。MSGV-FMC63-CD828BBZ 逆转录病毒载体由FMC63 scFv ，CD8 分子的铰链和跨膜区域，CD28 共刺激分子的胞质结构域，4-1BB 分子的胞质结构域，TCR-C 的胞质部分组成ζ分子和MSGV 逆转录病毒骨架（图1B ）。这两个CAR 中的信号元件组合是最有效的两个我们在正在进行的工作中使用结合了除FMC63 以外的scFv 的CAR 所测试的信号元件的组合（数据未显示）。 MSGV-FMC63-28Z 和MSGV-FMC63-CD828Z 用于转导用抗CD3 单克隆抗体OKT3 和IL-2 刺激的外周血单个核细胞（PBMC ）。为了测量基因转移效率，将细胞用与FMC63 scFv 结合的多克隆山羊抗小鼠Fab 抗体染色。与用FMC63-CD828BBZ 转导的细胞相比，用FMC63-28Z 转导的细胞表达可检测的scFv 水平的T 细胞百分比更高（图1C 和1D ）。作为对照，未转导的细胞也用多克隆山羊抗小鼠Fab 抗体染色（图1E ）。抗小鼠Fab 抗体不结合未转导的细胞。 用编码FMC63-28Z 或FMC63-CD828BBZ 的逆转录病毒转导的T 细胞在表达CD19 的靶细胞（包括原发性慢性淋巴细胞性白血病（CLL ））刺激后特异性产生IFN γ（表1 ）。响应于表达CD19 的靶细胞，FMC63-28Z 转导的T 细胞比FMC63-CD828BBZ 转导的T 细胞产生更多的IFN γ。 我们准备了一个稳定的生产者细胞克隆，该克隆可产生编码FMC63-28Z CAR 的逆转录病毒。该生产者细胞克隆被命名为H3 。当我们使用来自生产者细胞克隆H3 的含逆转录病毒的上清液进行转导时，通过在转导后四到五天对FMC63 scFv 进行染色来测量，有45-67 ％的T 细胞表达了FMC63-28Z （数据未显示）。 为了获得足够的T 细胞以用于临床过继T 细胞转移，转导的T 细胞必须转导后被诱导迅速增殖。因此，转导的T 细胞被诱导为使用快速扩增方案（REP ）[11,51] 可迅速增殖，其中将转导的T 细胞与OKT3 ，同种异体饲养细胞和IL-2 培养（图3A ）。图3B 显示，FMC63-28Z 的表达在REP 期间经历了706 倍的细胞数增加后，在转导的T 细胞上得以维持。我们将特异于半抗原2 、4 、6- 三硝基苯磺酸的CAR 用作阴性对照。该CAR 命名为SP6-28Z ，由MSGV-SP6-28Z 逆转录病毒载体编码。类似于FMC63-28Z ，此CAR 包含CD28 和TCR- ζ信号转导成分。SP6-28Z CAR 的表达为REP 后维持在转导的T 细胞上（图3C ）。FMC63-28Z 转导的T 细胞而非SP6-28Z 转导的T 细胞在启动REP 后九天被表达CD19 的靶细胞（包括原代CLL 细胞）刺激后特异性产生IFN γ（表2 ）。FMC63-28Z 转导的CD4 + 和CD8 + T 细胞在CD19- 中产生IFN γ和IL-2REP 发生后十四天的特定方式（图4 ）并被专门杀死，REP 启动前的同种异体原代CLL 细胞（图5A 和5B ）和21 个REP 启动后的几天（图5C ）。 因为我们的目标是进行抗CD19-CAR 转导的T 细胞用于治疗淋巴瘤和CLL 患者的临床试验，所以我们进行了一系列实验，其中转导了CLL 患者的PBMC ，并使用该方法总结在图3A 中。转导和快速扩增后，这些细胞几乎都是T 细胞，通常表达高水平的FMC63-28Z CAR （图6A ）。此外，T 细胞可能以CD19 特异性方式产生IFN γ（图6B ），并可能杀死自体CLL 细胞（图6C ）。我们转导并迅速扩增了六名不同CLL 患者的T 细胞。通过外周血淋巴细胞计数，患者的白血病负担有所不同。其中四名患者曾接受氟达拉滨和利妥昔单抗的治疗。从三名外周血淋巴细胞计数至少为9800 个细胞/ μL 的患者的PBMC 中耗尽了CD19 + 细胞。这种消耗消除了PBMC 样本中有96 ％的B 细胞（n=3 ，数据未显示）。因为CLL 细胞表达CD19 ，所以这种耗竭消除了这些样品中的大部分白血病细胞。耗竭后，立即用板载OKT3 刺激这三名患者的CD19 耗竭的PBMC 。来自其他三名CLL 患者的外周血淋巴细胞计数为7200 细胞/ μL 或更少的PBMC 样品接受了OKT3 的初始OKT3 刺激，即直接添加到他们的培养基中（溶解的OKT3 ）。转导了所有患者的细胞，最初的OKT3 刺激后10 天，使用REP 诱导它们增殖。这些实验的结果总结在表3 中。值得注意的是，来自外周血淋巴细胞计数为7200 细胞/ μL 且未消耗的患者的样品中，转导的T 细胞百分比和增殖均发生了最差的结果CD19 + 细胞。使用CLL PBMC 可以获得更好的转导和增殖结果，其中CLLC PBMC 的白血病细胞百分比低或大量白血病细胞中的CD19 + 细胞耗尽，然后再开始用板结合OKT3 培养。 产生细胞克隆H3 是我们所有转导实验中使用的含逆转录病毒的上清液的来源，除了图1 和2 以及表1 中报道的那些。为了进行使用FMC63-28Z 转导的T 细胞的临床试验，H3 细胞用于产生主细胞库，随后在良好生产规范（GMP ）条件下产生含逆转录病毒的上清液。分六批生产该上清液。表4 显示了使用该上清液转导的T 细胞以CD19 特异性方式产生IFN γ的转导效率和能力的摘要。 讨论 CD19 是抗原特异性免疫疗法的有希望的靶标，因为它在大多数恶性B 细胞[32,33] 中表达，而在正常组织中的表达仅限于B 细胞，也许在滤泡树突状细胞中也是如此[33,34] 。CD19 作为靶标的吸引力已经导致几个小组构建抗CD19 嵌合受体[30 、40 、53-55] 。唯一完成的抗CD19 CAR 临床试验是在过继转移之前使用电穿孔法转染T 细胞[56] 。在该试验中，T 细胞的持久性受到限制，并且未检测到抗淋巴瘤的作用56 。 有几个因素可能会影响抗CD19-CAR 转导的T 细胞过继性T 细胞疗法的疗效。CAR 的属性，例如包括哪些信号传导元件，用于培养和转导T 细胞的方法，转移的T 细胞数量，注入的T 细胞表型以及细胞因子（例如大剂量IL- T 细胞转移后2 可能都很重要。过继T 细胞疗法之前的免疫抑制可增强小鼠[57] 和人类[11] 中的抗肿瘤活性。CAR 的可变区源自鼠抗体，因此针对CAR 转化的T 细胞的人抗小鼠抗体的开发可能会限制其有效性[23,58] 。为了评估许多可能影响表达抗CD19 嵌合受体的T 细胞过继性T 细胞疗法的因素，我们正在计划进行一项临床试验，其中将对B 细胞淋巴瘤或CLL 患者进行抗CD19-CAR 治疗- 转导的T 细胞和大剂量IL-2 。该试验还将评估T 细胞转移前免疫抑制的作用。 为了确定最适合临床使用的CAR ，我们比较了两种包含信号传导元件组合的CAR ，我们发现这些信号传导元件在掺入除FMC63 以外的scFv 的CAR 中有效。两种CAR 都包含相同的抗CD19 scFv 成分和CD28 共刺激分子的信号传导部分（图1A ）。我们之所以决定包括CD28 部分，是因为先前有报道称含有CD28 信号传导部分的CAR 具有改善的体内持久性和抗肿瘤功效[22,25,26] 。我们选择了在FMC63-28Z CAR 中使用CD28 和TCR- ζ特定序列，因为在我们小组进行的未发表工作中，当这些序列与几种不同的scFv 部分结合使用时，它们与高水平的CAR 表达和抗原特异性细胞因子产生相关。我们比较的一种汽车，FMC63-CD828BBZ ，含有4-1BB 分子的胞质区域。我们评估的另一个CAR ，FMC63-28Z ，不包含4-1BB 部分。先前已证明4-1BB 分子可增强抗原特异性T 细胞的增殖和体内持久性[28,29] ，其他研究人员已表明4-1BB 部分的掺入可增强CARs 的体外功能[30,31] 。具体的FMC63-CD828BBZCAR 中包含的CD828BBZ 序列用于本文报道的实验中，因为与未使用FMC63 的CAR 相比，我们小组在未发表的研究中使用了具有除FMC63 以外的scFv 的CAR ，该序列提高了体外存活率并增加了抗原特异性细胞因子的产生4-1BB 部分。我们评估的两种CAR 的胞外铰链区也不同（图1 ）。当我们比较抗CD19 CARs 的scFv 成分在转导T 细胞表面的表达时，我们发现在FMC63-28Z 转导的T 细胞上始终存在较高的表达（图1 ），和FMC63-28Z 转导的T 细胞相比，FMC63-28Z 转导的细胞产生更高水平的IL-2 （图2B ），即使在允许FMC63-CD828BBZ 转导的T 细胞上抗CD19 CAR 表达较低的情况下（图2B ）。IL-2 产生的减少可能是由于CD8 铰链区或4-1BB 成分的存在导致表达的CAR 蛋白结构的差异。IL-2 降低用含有4-1BB 部分的CAR 转导的T 细胞产生的T 细胞产生的出乎意料的是，因为通过连接天然的4-1BB 分子，T 细胞的IL-2 产生已经显示出基本上增加了[59] 或适度增加了[60] 。表达于T 细胞是4-1BB 配体分子。我们比较FMC63-28Z 和FMC63-CD828BBZ 的目的是选择两个有前途的CAR 中最好的一个用于临床试验，而不是正式评估4-1BB 信号转导如何影响CAR 转导的T 细胞。因为我们比较的两个CAR 包含不同的细胞外铰链区，所以我们的实验不能评估4-1BB 在CAR 中的功能。4-1BB 是一种可能在体内增强CAR 功能的分子，有必要进行进一步的体内研究以评估4-1BB 增强表达CAR 的T 细胞抗肿瘤功效的能力。 我们选择了FMC63-28Z CAR 进行进一步测试，并制备了能够产生编码该受体的逆转录病毒的生产细胞克隆。这些编码FMC63-28Z 的逆转录病毒可有效地转导T 细胞。转导的T 细胞可以诱导IFN γ和IL-2CD19 特异性方式，它们可以杀死原代CLL 细胞。重要的是，在诱导转导的T 细胞增殖到足以进行临床过继T 细胞转移的量后，测试T 细胞时，所有这些T 细胞功能都得到了展示（图3-5 和表2 ）。 当黑色素瘤患者的肿瘤浸润性T 细胞在高浓度IL-2 存在下在OKT3 刺激后经过长时间的体外培养时，与T 细胞相比，T 细胞通常表达低水平的CD28 ，CD27 ，CD62L ，CCR7 和CD127 。在正常循环T 细胞表面上发现的这些蛋白质的水平[61] 。这些T 细胞的表型通常是效应记忆T 细胞[62] 的表型。记忆性T 细胞作为治疗方案的一部分进行输注时，可以在大约50 ％的患者中介导黑色素瘤的客观消退，包括细胞输注前消耗淋巴细胞的化学疗法以及T 细胞输注后高剂量IL-2 的治疗[12] 。FMC63-28Z 转导的T 细胞中的50 ％在培养期20 到24 天结束时也具有效应记忆表型，这是制备足够的细胞用于临床过继T 细胞转移所需的（数据未显示）。要记住的重要一点是，输注后培养的T 细胞的表型可能会改变。我们的小组已发表的数据显示，在输注细胞后的一周内，表达CD127 和CD28 的输注黑色素瘤抗原特异性T 细胞的百分比迅速增加。 B 细胞恶性肿瘤患者的过继性T 细胞疗法带来了一些独特的挑战。CLL 细胞会产生几种潜在的免疫抑制细胞因子，例如转化生长因子- β白细胞介素-4 和白细胞介素10 [65] 。此外，将在我们建议的临床试验中接受治疗的患者都有使用免疫抑制化学药物治疗的历史，例如氟达拉滨[66] 参加试验之前。这些因素使得评估CLL 患者T 细胞的增殖能力是我们临床前实验的重要重点。一些患有B 细胞恶性肿瘤的患者拥有大量循环性恶性细胞，可能会干扰T 细胞培养和转导过程，因此有必要在T 细胞培养和转导之前测试消除这些恶性细胞PBMC 的过程。因此，我们使用来自有CLL 的患者。我们发现，以前用氟达拉滨和抗CD20 单克隆抗体利妥昔单抗治疗过的CLL 患者的T 细胞可以用溶解的OKT3 诱导增殖，并且当从白血病细胞水平相对较低的患者获得T 细胞时可以有效地转导在他们的血液中（外周血淋巴细胞计数为440 万个细胞/ μL 或更少）。相反，当白血病水平较高时细胞存在于血液中，响应溶解的OKT3 的增殖和转导受到损害（表3 和数据未显示）。我们从含有大量白血病细胞的PBMC 样品中去除了CD19 + 细胞，然后将CD19 缺失的PBMC 应用于已用OKT3 包被的板上。使用这种方法，我们可以转导CLL 患者的T 细胞并诱导其增殖（表3 ）。值得注意的是，来自不同CLL 患者的T 细胞增殖存在极大差异（表3 ）。 我们更喜欢使用CD19 + 细胞耗竭来将外周血T 细胞与白血病细胞分开。这种方法使T 细胞保持不变，从而避免了由于T 细胞与抗CD3 抗体包被的磁珠结合而对T 细胞增殖和生存能力造成的任何潜在负面影响。例如，如果在选择后任何抗CD3 包被的珠保持附着在细胞上，则抗CD3 抗体OKT3 对T 细胞的激活可能被抑制。 本手稿中描述的细胞培养和转导过程可轻松适应良好生产规范（GMP ）条件。唯一需要进行的主要修改是使用临床级抗CD19 磁珠和CliniMacs® 系统来耗尽表达CD19 的细胞（抗CD19 磁珠和CliniMacs® 系统均来自Miltenyi ），并使用更大的烧瓶和细胞REPs 的培养袋。到目前为止，我们已经在一个大型实验中测试了这种方法。结果与本文报道的小规模实验获得的结果一致（数据未显示）。本文详细介绍的耗竭，培养和转导程序将用于已经进行过的临床试验。由我们机构的内部审查委员会和美国食品药品监督管理局批准。在这项临床试验中，患有CD19 表达B 细胞恶性肿瘤的患者将接受FMC63-28Z 转导的T 细胞治疗。 致谢 作者感谢Arnold Mixon 和Shawn Farid 对流式细胞仪的帮助。 这项工作得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心的资助 参考文献：太多，省略请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。 返回搜狐，查看更多 责任编辑：