原标题：Active Motif 推出 GoldCLIP 技术服务引言 Active Motif 通过中国科学院生物物理研究所俞洋课题组提供技术支持，推出GoldCLIP技术服务，助力RNA研究。 核酸与蛋白质的互作在生物体内发挥着不可或缺的作用。传统上研究RNA和蛋白质互作主要有两种方法。 其一是RIP技术（RNA Immunoprecipitation）， 其二是CLIP技术（UV crosslinking and immunoprecipitation）。 RIP技术 RIP技术通过纯化RNA和RNA结合蛋白的复合物来研究RNA结合蛋白所结合的RNA。其优点是步骤少，操作简单。主要缺点在于存在细胞裂解后核酸飘逸的现象，因此在RIP的数据中假阳性的结果比较多，而且也无法得知RNA和蛋白的具体结合位点。 CLIP技术 为了克服RIP的缺点，2003年，Darnell实验室最先发表了通过紫外交联的方法来研究RNA和蛋白质互作的相关文章，即CLIP技术。其基本步骤如图1所示。 （1）通过紫外光照射使蛋白和RNA进行交联； （2）裂解细胞后，对复合物进行RNA酶消解，截短复合物中RNA的长度； （3）体外沉淀蛋白质核酸复合物； （4）在RNA的3’端加上接头； （5）在RNA的5’端标记上同位素32P； （6）通过SDS-PAGE胶和转膜到硝酸纤维素薄膜上纯化蛋白RNA复合物，并通过放射自显影切膜回收蛋白RNA复合物； （7）降解蛋白回收RNA； （8）在RNA的5‘端加上接头； （9）反转录成cDNA文库。其后通过建库试剂盒对cDNA文库进行扩增建库后，上机高通量测序，就可以得知蛋白质特异性结合的序列。 图1 CLIP技术的基本操作流程 其优点是得到的数据特异性高，同时能够得知蛋白和核酸交联的位置。其缺点也很明显就是步骤多，操作的要求极高。 GoldCLIP技术 为了提高CLIP技术的效率，中国科学院生物物理研究所俞洋组改进了传统的CLIP技术，提出了GoldCLIP技术(Gel-omitted and ligation-dependent CLIP)。通过利用Halo-tag的特性简化在体外纯化蛋白质和核酸复合物的步骤，从而省略了体外胶膜纯化蛋白RNA复合物的步骤。在体外，Halo-tag是经基因工程改造的脱卤素酶，其活性中心只能与含有卤素的配体以共价键的形式相互结合，而且该共价键不能打开。因此，当将靶蛋白和Halo标签融合后，含有Halo-tag的蛋白RNA复合物就可以与含有卤素配体的磁珠共价偶联。这样就能在体外进行严格地洗涤，从而简化了胶膜纯化的步骤。Halo标签的分子量为33kDa，可以结合在靶蛋白的N端或者C端。该融合蛋白可以在原核或真核表达系统中表达。GoldCLIP的流程如图2所示。首先通过磁珠分离蛋白RNA复合物，然后在RNA的3’端加上接头，接着通过蛋白变性剂，如Urea，Guanidine，SDS等，对蛋白RNA复合物进行洗涤，最后得到高纯度的蛋白RNA复合物。然后降解蛋白，回收RNA。将RNA转录成cDNA后进行建库、测序、分析即可。图2 GoldCLIP的简要流程图 GoldCLIP技术发表于最新GBP杂志 GoldCLIP技术发表于最新的GBP杂志上。文章中用GoldCLIP技术研究了PTB蛋白（polypyrimidine-tract binding protein）并和前人的结果进行了比较。PTB蛋白是一个经典的RNA结合蛋白，他通过结合CU-rich的motif来对体内的RNA的转录进行调控。在文章中，他们使用了两种紫外交联方式对PTB蛋白进行了交联，分别是UVC（波长254nm）和UVA（波长365nm）。结果如图3所示，GoldCLIP技术可以较好的重复以前的文献发表的实验结果。因为使用了Halo-tag，可以通过磁珠在体外pull down蛋白后，直接用变性剂进行复合物的纯化，省略了跑胶转膜的步骤。众所周知，转膜的效率很难估计，而且切胶回收的偏移率也很大，会造成最后数据的损失和偏移。因此，最好的方法就是直接洗涤，这样操作简单，可以把数据损失和偏移降到最低。图3 GoldCLIP识别的PTB结合位点 因此与传统CLIP技术相比，GoldCLIP技术不仅简化了实验操作步骤，同时减少了数据损失和漂移，是研究RNA和蛋白相互作用位点时的更加理想的方法。Active Motif 得到GoldCLIP技术发明者中国科学院生物物理研究所俞洋课题组技术支持，推出GoldCLIP技术服务。了解更多信息或技术服务咨询欢迎联系我们。 参考文献： [1] GoldCLIP[2] Wheeler EC, Van Nostrand EL, Yeo GW. Advances and challenges in the detection of tranome-wide protein-RNA interactions. Wiley Interdiscip Rev RNA 2018;9. doi: 10.1002/wrna.1436. [3] Ule J, Ule A, Spencer J, Williams A, Hu JS, Cline M, et al. Nova regulates brain-specific splicing to shape the synapse. Nat Genet 2005;37:844−52. [4] Licatalosi DD, Mele A, Fak JJ, Ule J, Kayikci M, Chi SW, et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature 2008;456:464−9. [5] Hafner M, Landthaler M, Burger L, Khorshid M, Hausser J, Berninger P, et al. Tranome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell 2010;141:129−41. [6] Konig J, Zarnack K, Rot G, Curk T, Kayikci M, Zupan B, et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol 2010;17:909−15. [7] Van Nostrand EL, Pratt GA, Shishkin AA, Gelboin-Burkhart C, Fang MY, Sundararaman B, et al. Robust tranome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods 2016;13:508−14. [8] Zarnegar BJ, Flynn RA, Shen Y, Do BT, Chang HY, Khavari PA. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nat Methods 2016;13:489−92. [9] Kim B, Jeong K, Kim VN. Genome-wide mapping of DROSHA cleavage sites on primary microRNAs and noncanonical substrates. Mol Cell 2017;66:258−69.e5. [10] Granneman S, Kudla G, Petfalski E, Tollervey D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106:9613−8. 相关内容： 还在为实验头痛？Active Motif 表观遗传技术服务来帮您 扫一扫返回搜狐，查看更多 责任编辑：