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shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应（在下面进一步讨论）。一般方案设计siRNA和shRNA许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是，每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外，长双链RNA会激活先天免疫反应，导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素，包括环结构，发夹结构热力学性质，二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时，要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的，而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得

19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的。长于30个核苷酸可导致非特异性沉默。

识别的理想位点包括靶mRNA序列中的AA二核苷酸区和3\\\'端19个核苷酸的位点。通常情况下，siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高。较新的数据表明，其他种类的二核苷酸也可保持活性，但siRNA能够被核糖核酸酶在单链的G残基处裂解，因此应避免GG结构。

由于mRNA往往高度折叠并于调控蛋白结合的，应该要在不同位点选择至少2-4个靶序列。避免设计含有4-6个poly（T）的序列，因为它会作为RNA合成酶III的终止信号。

检查以确保您的siRNA序列与其他编码序列没有同源性。

序列中的G/C含量应该在35-55％之间。

公司/组织程序名称描述链接

Thermo Scientific	siDESIGN	方便使用的siRNA设计工具。允许选择siRNA识别的区域（5’或3’ UTR或ORF区），G/C百分比，可通过BLAST搜索序列。	链接
Naito et al.	siDirect	根据核苷酸序列识别目标，提供了序列内的位置，可供选择双链的熔解温度，脱靶序列的不匹配的最小数目。	链接
Invitrogen	BLOCK-IT RNAi Designer	在核算序列内识别siRNA, shRNA和miRNA目标。也可将siRNA序列转化为shRNA序列。	链接
InvivoGen	siRNA Wizard	可搜索一段编码序列作为siRNA序列，可根据您的siRNA序列设计加扰序列和发夹插入。	链接
IDT	shRNA设计工具	shRNA设计工具能允许您在四个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点。	链接
Gene Link	shRNA设计工具	shRNA设计工具能允许您在三个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点，设计GC含量和长度。	链接

表二：siRNA和shRNA设计程序。shRNA应包含正义和反义序列（每个为19-21个核苷酸的长度）由环结构分隔，以及5\\\'端AAAA的游离片段。设计环结构时，Ambion的科学家和其他人建议使用9 nt的空白间隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些载体中采用了长度为7 nt的环（TCAAGAG），这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外，当创建shRNA盒时，正义链首先合成，然后是间隔序列，最后是反义链。 shRNA结构中5\\\'端游离应避免，因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA，也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外，多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列（代表性例子见表三）。多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶III U6启动子驱动，它驱动高水平的组成型表达，或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比，shRNA的一个主要优点是，shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统，以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用，它不像病毒载体递送分子，可以通过如上所述的siRNA分子一样，能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。公司/机构程序名称他们能提供什么Link

The Broad Institute （可通过Sigma-Aldrich和Thermo-Fisher Scientific进入）	RNAi联营（TRC）	通过公共-私人的努力，目的是创造一个经验证的shRNA文库和可用于确定人和小鼠基因功能的关联工具	链接链接到RNAi联营shRNA文库:链接
Sigma-Aldrich	功能基因组&RNAi（与TRC协同）	提供细菌甘油存储、质粒DNA和慢病毒形式的TRC shRNA	链接
Thermo-Fisher Scientific	SMARTchoice, GIPZ, TRIPZ Inducible, 和TRC慢病毒shRNA选项	提供细菌甘油存储和慢病毒形式的TRC shRNA。	链接

表三：提供预制的siRNA和shRNA的公司。对照为确保RNA干扰（RNAi）处理后观察到的效应是基因沉默的结果，而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA，或由于RNA干扰途径激活造成的，很重要的一点在于设置相应的对照组（表三）。两种最常见的对照是加扰对照（Scrambled Control）和非识别对照（Non-targeting Control）。加扰对照正像它听起来的那样，包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照，在另一方面，也是一个siRNA/shRNA序列，它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制，使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而，应该指出的是，即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径，但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此，在设计加扰对照序列的时候要特别小心，以确保遵循上述原则，且不会锚定其他的mRNA序列。对于shRNA，另一个重要的对照包括空载体对照，它不包含任何shRNA插入，却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后，未经处理的细胞（无转染或转导）可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。公司/机构描述

Sigma-Aldrich	shRNA非识别对照
空载体对照
Thermo Scientific	shRNA阳性对照（识别eGFP）
空载体对照
Invitrogen	加扰siRNA对照
	肌动蛋白, GAPDH, 或GFP阳性对照

表四：RNAi对照。转运确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型，因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同，包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默，以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的，而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。质粒DNA或双链RNA的转染或电转转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成，使它们能够穿过细胞膜。 质粒编码的siRNA，有时也有shRNA，通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。

脂质转染。具有长疏水链头部带正电荷基团的阳离子脂质体与带负电荷的siRNA相互作用，在脂双分子层环绕siRNA，随后被细胞内吞。

基于阳离子聚合物的纳米粒子。

这可降低毒性，提高效率，并且能够转运修饰的siRNA。

脂质或细胞穿透肽（CPP）结合。这涉及到siRNA与疏水性基团（如胆固醇）或阳离子CCP（如转运蛋白或pentatratin）的结合，能够促进向靶细胞的转运。

RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。[放大]图 1.siRNA和shRNA结构。（A） siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。 （B） shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。（C） shRNA 构建用于插入表达载体。源自 [1,2] 。背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。Biosettiaprovide innovative tools and specialty reagents to aid in genome-wide functional analysis and generation of induced pluripotent stem cells (iPSC). These include:single-strand RNAi technology,microRNA expression systems,normalized full-length cDNA librariesandlentiviral delivery systems.we have extended our research and development efforts to the fields of stem cell research, identification of cancer biomarkers, and discovery of next generation drug targets.

Product Name	pLV-H1-EF1a-Puro
Product Catalog Number	SORT-B19
Shipping Conditions	Shipped at room temperature. Please note that additional shipping charges may apply.
Storage Conditions	Store at -20 degrees Celsius. All reagents are stable for 6 months when properly stored.
Protocol	Download PDF
Plasmid Sequence	Genbank

Cat#:SORT-B19温馨提示：不可用于临床治疗。

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