方案：用于流式细胞术的细胞表面抗体染色相关方案：用于流式细胞术的细胞内抗体染色一抗和二抗偶联物越来越多地收集数千种标记的一抗和二抗流式细胞术试剂细胞活力染色剂、增殖染料、标记抗体及更多用于 flowLive-or-Dye™ Fixable Viability染色用于流式细胞术或荧光显微镜的可固定死细胞染色剂分享文章与同事分享这篇文章。复制链接发送电子邮件用于流式细胞术的细胞外染色流式细胞术的细胞染色有许多方案。协议可能需要针对不同的细胞类型、目标或应用程序进行优化。这是我们用于流式细胞术的悬浮细胞中细胞表面表位细胞外染色的基本方案。对于细胞内染色，请参阅我们的方案：流式细胞术的细胞内抗体染色。所需材料：Live-or-Dye™ 可固定活性染色剂死细胞核酸染色（可选）一抗二抗（如果使用标记的一抗则不需要）流动缓冲液（PBS + 2% 牛血清或 BSA + 0.02% 叠氮化钠）流式细胞仪管（12 x 75 mm 聚丙烯管）工作流程概述：将细胞等分到流管中一抗孵育（30 分钟）洗涤和离心（5 分钟）2x 固定后洗涤（可选）二抗孵育（标记的一抗不需要）（30 分钟）洗涤和离心（5 min.) 2x（如果进行了固定，可选择停止点）通过流式细胞仪分析程序：通过胰蛋白酶消化或使用商业非酶促细胞提升溶液将贴壁细胞与底物分离。可选：要从分析中排除死细胞，请在 PBS 或 PBS 中重悬细胞根据产品协议，其他无蛋白缓冲液和带有可固定死细胞染料的染色细胞，例如我们的 Live-or-Dye™ Fixable Viability Stains。注意：如果不进行细胞固定，不可固定死细胞细胞染色剂，如 PI 或 7-AAD，可与一抗或二抗一起添加。将流动缓冲液中的细胞密度调整为每毫升 107 个细胞。每个流式细胞术管等分 100 uL 细胞悬浮液，每管总共 106 个细胞管子。将试管置于冰上。将一抗加入试管中并轻轻涡旋混合。在冰上（或 4°C）孵育试管 30 分钟。如果使用直接偶联的荧光一抗，管应避光。注意：一抗浓度必须针对不同的应用进行优化，但每管 0.5-1 ug 抗体是常见的起始浓度。通过向每个管中加入 1 mL 流动缓冲液进行洗涤通过离心 5 分钟分离管和沉淀细胞。以 350 x g 的速度将洗涤缓冲液从试管中倒入废液容器中。重复洗涤（步骤 6-7）。可选：在此步骤中可以使用您喜欢的固定剂固定细胞。固定后，按照步骤 6-7 进行清洗。如果使用直接标记的一抗，请继续执行步骤 14。如果使用标记的二抗y 抗体，继续步骤 11。倒出洗涤缓冲液后，通过温和涡旋将细胞重悬于残留缓冲液 (~100 uL) 中。将 1 ug 每种二抗添加到每个试管中并轻轻涡旋混合。在室温下避光孵育 30 分钟。注意：对于生物素化一抗，链霉亲和素结合物可用于检测，通常为 0.25 微克/管。在流动缓冲液中洗涤细胞两次（重复步骤 6-7）。之后倒出洗涤缓冲液，每管添加 500 uL 流动缓冲液。通过流式细胞仪在正确的通道中分析您的偶联物。在将每个样品加载到细胞仪上之前，通过温和涡旋混合。注意：如果在步骤 7 中执行固定，则细胞可以在 4°C 下避光保存几天，然后再进行分析。