返回突出显示的引文使用统计推断的快速三色单分子 FRET 分享文章与同事分享这篇文章。复制链接发送电子邮件Förster 共振能量转移 (FRET) 是研究生物系统构象变化或结合相互作用的理想工具，因为它对变化敏感在纳米级的荧光团之间的距离。具有一个供体和一个受体的双色 FRET 受一维空间分辨率的限制。因此，可以从数据中推断出的动力学模型是有限的。使用连续波激光激发开发了三色 FRET 光谱分析，以研究在微秒到毫秒时间尺度上发生的快速分子过程。三色 FRET 使用一个供体和两个受体荧光团来提高生物大分子分子构象的空间分辨率。三色FRET受到挑战因为引入额外的受体激发会增加光物理问题，包括光闪烁、快速光漂白和低量子产率。选择用于标记肽的反应性荧光团（包括 CF®680R 马来酰亚胺）具有光稳定性并具有高量子产率，从而克服了这些挑战。作者使用两个特征良好的模型系统测试了三色 FRET：蛋白质从头折叠设计了三个螺旋束 (alpha3D) 以及肿瘤抑制蛋白 p53 (TAD) 的 N 末端反式激活结构域与其结合伙伴之一 (NCBD) 的结合。通过跟踪供体和受体的荧光强度监测两个系统的折叠和结合动力学，并与简单的双态模型相匹配。作者得出结论，与一维探针相比，三色 FRET 可以更准确地表征折叠和结合途径。在另一篇使用三色 FRET 的出版物中，Kim、JY 和 Chung, HS 研究了 TAD 和 NCBD 耦合折叠和结合的过渡状态。过渡态是随机的，不能同步进行整体测量，但通过使用单分子三色 FRET，作者能够获得单个过渡态的多距离结构和动力学信息。作者在这些研究中证明了单分子三色FRET 可用于蛋白质折叠、结合动力学以及折叠和无序蛋白质的过渡状态的未来研究。三种不同的荧光团特异性地附着在 α3D 上。 Alexa 488（供体，D）和 Alexa 594（受体 1，A1）分别连接到 N 末端的 4-乙酰苯丙氨酸 (UA) 和残基 33 的半胱氨酸。然后，使用分选酶介导的短肽 GGGC 连接，将半胱氨酸残基连接到 C 末端。该半胱氨酸残基用 CF680R（受体 2，A2）标记。标记的蛋白质固定在聚乙烯上使用生物素-链霉亲和素连接的乙二醇 (PEG) 涂层玻璃表面。在双色 FRET 中，两个荧光团的位点特异性标记通常不是必需的，因为具有不同供体和受体位置的两种物质不会导致 FRET 效率的显着差异，除非荧光猝灭发生在两个标记位置之一。然而，在三色FRET中，例如当A1和A2切换时，D和A1之间以及D和A2之间的距离变得不同。 b. D 和 A1 分别连接到反式激活结构域 (TAD) 的 N 端和 C 端的 4-乙酰基苯丙氨酸和半胱氨酸残基，固定在表面上。 TAD 与 A2 标记的 NCBD 在溶液中孵育，浓度接近解离常数，以监测结合和解离事件。图片来源：J. Yoo 等https://doi.org/10.1038/s41467-020-17149-w 根据知识共享许可转载。了解更多关于反应性 CF® 染料的信息，GloMelt™ 热蛋白稳定性测定和 Mix-n-Stain™ 标记试剂盒。完整引用 Yoo, J., Kim, JY., Louis, J.M. 等。使用统计推断的快速三色单分子 FRET。 Nat Commun 11, 3336 (2020)。 https://doi.org/10.1038/s41467-020-17149-wKim, JY 和 Chung, HS，无序蛋白质在折叠和与伙伴结合时遵循不同的过渡路径。科学 368, 1253 (2020) https://doi.org/10.1126/science.aba3854