方案免疫荧光方案 - 甲醛固定 1. 从 T.c.unit 收集细胞并使用吸力从培养皿中去除培养基。 2. 用 1x PBS 清洗并取出。 3. 在预热 (37°C) 多聚甲醛中在定轨振荡器上室温孵育细胞 12 分钟。 4. 除去 PFA 并在 1x PBS 中的 0.5% Triton X-100 中室温孵育 5 分钟。 5. 准备封闭剂，这也是抗体的稀释剂。 6. 在室温下用 1x PBS 洗涤细胞 2x，每次 4 分钟/在定轨振荡器上洗涤。 7. 在室温下用 1% NCS 和 1x PBS 封闭 30 分钟。 8. 准备一抗（50 升/盖玻片）和湿润的染色室。 9. 在室温下用 1x PBS 洗涤细胞 2 次并短暂风干。 10. 在染色室中避光室温下与一抗孵育 1 小时。在此期间准备二抗。 11. 用 1x PBS 洗涤细胞 5 次（更换 5 次烧杯/每个烧杯计数 5 次）12. 孵育用二抗在染色室中避光室温孵育 1 小时。 13. 用 1x PBS 洗涤细胞 5 次。 14. Mount in Dapi.Solutions（染色当天新鲜制备）。 * 1x 磷酸盐缓冲盐水。 * 封闭试剂：1x PBS 中的 1% NCS（使用新鲜的 10x PBS）。 * 固定溶液：3.5% 多聚甲醛。1.75g PFA 溶于 20 ml d.H2O 加 5 滴 1M NaOH。在 50-60°C 的热板上搅拌直至溶解。添加 4 滴 IN HCI 并检查 pH 指示剂条。 PH 应为 7.4。用 d.H2O 完成体积至 25ml，并加入 25ml 2xPBS。在添加到盖玻片之前检查 pH 值。免疫荧光方案 - 甲醇/丙酮固定 1. 从 T.C.unit 收集细胞并使用抽吸从培养皿中去除培养基。 2. 用 1x PBS 清洗并取出。 3. 用冷的甲醇：丙酮1：1 冰上固定细胞10 分钟。 4. 准备封闭试剂，这也是抗体的稀释剂。 5. 去除固定剂并在室温下用 1x PBS 清洗细胞 3 次，持续 4 分钟/在眼眶沙上清洗克尔。 6. 用 1% NCS 和 1x PBS 在室温下封闭 30 分钟。 7. 准备一抗（50μl/盖玻片）和湿润的染色室。 8. 在室温下用 1 x PBS 洗涤细胞 2 次，然后风干大约 7 分钟。 9. 在染色室中避光室温下与一抗孵育 1 小时。在此期间准备二抗。 10. 用 1x PBS 洗涤细胞 5 次（更换 5 次烧杯/每个烧杯计数 5 次） 11. 在染色室中于室温下避光孵育二抗 1 小时。 12. 用 1x PBS 洗涤细胞 5 次。 13. 装入 Dapi.Solutions（在染色当天新鲜制备） * 1x 磷酸盐缓冲盐水。 * 封闭剂：1x PBS 中的 1% NCS（使用新鲜的 10x PBS）。 * 固定溶液：甲醇：丙酮 1:1 冰冷。Western Blotting Protocol 1. 将凝胶转移到 PDVF 或硝酸纤维素膜上 2. 将膜放入封闭缓冲液中的塑料托盘中搅拌一小时 3. 在洗涤缓冲液中冲洗 4. 在洗涤缓冲液加一抗dy 1 小时 5. 用洗涤缓冲液洗涤 6 X 5 分钟 6. 在洗涤缓冲液和二抗中孵育一小时 7. 用洗涤缓冲液洗涤 6 X 5 分钟 8. 检测（例如根据制造商的说明使用 ECL、Amersham）洗涤缓冲液 PBS + 0.1% Tween 20Blocking buffer Wash buffer + 5% 奶粉 使用的抗体浓度取决于每种抗体、抗原的量和使用的检测方法。稀释度一般在几百倍到几千倍的范围内，但通常要根据经验来确定。