主页使用具有化学成分确定的培养基的透气性快速膨胀 (G-Rex®) 培养器皿进行简单而稳健的 T 淋巴细胞扩增使用具有化学成分确定的培养基的透气性快速膨胀 (G-Rex®) 培养器皿进行简单而稳健的 T 淋巴细胞扩增< p class=\"published\">发表于 2021 年 11 月 7 日基于 G-Rex 的 T 淋巴细胞扩增

Randy Alfano，博士，InVitria 产品开发副总裁

简介

作为免疫细胞疗法继续显示出有前途的临床疗效，制造平台的进步必须同时继续，以加强过程控制、定义，并最终提高过程产量。一次性使用的透气快速膨胀 (G-Rex) 容器为免疫细胞扩增放大和缩小提供了实用、稳健且具有成本效益的解决方案。已发表的研究表明，在产品开发的早期阶段建立的流程很容易转化为大规模生产，而对 ce 的更改最小ll product.1 此外，由于 G-Rex 容器的独特设计，可以使用大量培养基来最大限度地减少容器操作并减少所需的劳动力。最后，G-Rex 的应用已被证明在扩增动力学和由此产生的扩增表型方面在供体之间具有高度的可重复性。2

然而，过程控制和可重复性的程度在很大程度上也取决于不仅在使用的膨胀容器上，还有容器内的生长介质。大多数用于临床用途的免疫细胞扩增的细胞培养基要么含有低百分比的人血清，要么含有从人血清中纯化的成分，例如白蛋白和转铁蛋白。例如，血清白蛋白能够显着增强离体培养的哺乳动物细胞的细胞生长和活力。鉴于白蛋白（体内和体外）的核心功能作用及其在细胞培养基中的高浓度，原材料质量的不一致可能极大地影响蛋白质的整体功能。3

InVitria 利用无动物成分的蛋白质表达平台大规模生产对细胞培养应用至关重要的重组蛋白质，包括人血清白蛋白和转铁蛋白。4， 5 这些不含动物成分的成分用于配制完全化学成分明确的制剂，专用于人类 T 淋巴细胞扩增。这种称为 OptiPEAK T 淋巴细胞的无血制剂与 G-Rex 配对，并与补充有 5% 人血清的标准无异种制剂 XViVo-15 进行比较。

此处提供的数据表明从 G-Rex 中健康供体的外周血中分离出的人类 T 细胞，化学成分确定的制剂表现出强大的扩增动力学。此外，为 G-Rex 收获的扩增细胞表现出高活力和与 XViVo 制剂相当的表型。综合起来，这些数据提供了 G-Rex vess 的主要证据els 可与化学成分确定的无血培养基一起使用，以提高细胞培养过程的生产力以及扩增细胞产物的质量和可重复性。

方法

基于 G-Rex 的 T 淋巴细胞扩增< /p>

健康捐赠者的外周血来自商业来源（ZenBio，Research Triangle Park，NC）。所有血样在采集后最长 48 小时内进行处理。为了分离淋巴细胞，使用密度为 1.077 ± 0.001 g/mL 的 Lymphoprep 梯度（StemCell Technologies, Vancouver, BC）从全血中分离 PBMC，随后用基础 RPMI1640（Life Technologies, Grand Island, NY）洗涤以去除所有痕迹

PBMC 在 100 ng/mL αCD3、50 ng/mL αCD28（Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国）的存在下以 1 x 106 个细胞/mL 的密度接种在 T 瓶中) 和 10 ng/mL rhIL-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ) 在 OptiPEAK T 淋巴细胞（InVitria, Junction City, KS）或XViVo-15（Lonza，Walkersville，MD）在 37 °C 和 5% CO2 条件下含有 5% 人血清（Sigma Aldrich，St. Louis，MO）。

随后通过离心收获活化细胞并重悬在每个培养基的最小体积中补充 10 ng/mL rhIL-2，并使用基于 Calcein AM 的流式细胞术进行活细胞定量的预门控流式细胞仪计数（Accuri，BD Biosciences，East Rutherford，NJ）。为了将活化的 T 细胞接种到 G-Rex10 容器（Wilson Wolf，St Paul，MN）中，在接种细胞之前，将 4 mL 培养基 (4 mL/cm2) 在 37 °C 和 5% CO2 下平衡至少两小时。活化的 T 细胞以 1-5 x 105 个细胞/cm2 的初始细胞密度接种。在接种后 24 小时，通过添加额外的 36 mL 生长培养基来喂养 G-Rex 容器。

在整个生长期抽取样本用于葡萄糖测量和细胞计数。使用基于钙黄绿素 AM 的流式细胞仪对活细胞进行预门控流式细胞仪进行细胞计数l 量化。

G-Rex100容器遵循相同的过程。

细胞表型分析

扩增后，从G-Rex容器中收集细胞并向下旋转以去除所有生长介质的痕迹。将细胞重新悬浮在补充有 10% FBS、0.1% F-68（Thermo Fisher，Waltham，MA）的 DPBS 中。然后用小鼠 APC α 人 CD3、小鼠 PE α 人 CD4（BD Biosciences，东卢瑟福，新泽西州）和小鼠 Pe-Cy7 α 人 CD8（Biorbyt，圣路易斯，密苏里州）在室温下染色 30 分钟。在预门控流式细胞仪（Accuri，BD Biosciences，East Rutherford，NJ）上分析细胞。

统计

均值差异是使用学生的未配对 t 检验确定的95% 置信区间 (CI)。

结果

在化学定义条件下基于 G-Rex 的 T 细胞扩增表现出稳健的生长动力学

建立血清中 T 细胞的扩增动力学使用 G-Rex 的自由条件，使用 αCD3/αCD28 可溶性抗体激活的 T 细胞如方法部分所述，e 以 1-5 x 105 个细胞/cm2 的密度接种在 OptiPEAK T 淋巴细胞或标准 XViVo-15 + 5% 人类男性 AB 血清中的 G-Rex10 容器中，来自 10 个独立供体，持续 7 天。

两种培养基中的 T 细胞在 G-Rex 中都表现出强大的扩增动力学，在容器接种后 48 小时内检测到细胞生长（图 1）。补充了人血清的 XViVo 在扩增的供体中表现出平均 33.64 ± 13.02 倍的扩增。 OptiPEAK T 淋巴细胞表现出相似的扩增动力学。捐助者扩张 7 天后显示出 36.90 ± 11.98 倍扩张 (p ≥ 0.05)。扩张 7 天后，捐助者表现出可变的扩张行为。部分捐助者继续扩大到 50-60 倍以上，而其他捐助者停止增长（数据未显示）。

图 1 化学成分确定的培养基 OptiPEAK T 的膨胀动力学与 XViVo-15+5% HS 相比，G-Rex10 中的淋巴细胞。

还通过扩增细胞产物的流式细胞术测定了细胞活力。发现在 XViVo 中扩增的细胞为 85.81 ± 8.69 % 存活率，而 OptiPEAK 显示略有增加，但统计上不显着，增加了 90.54 ± 8.05% 的存活率。

为了确定化学成分确定的培养基的可扩展性，用两个供体对较大的 G-Rex100 进行了评估。比较了 OptiPEAK T 淋巴细胞和 XViVO-15 + 5% HS 之间的动力学。与 G-Rex10 容器相比，G-Rex100 容器的细胞培养表面增加了一个数量级。G-Rex100 还具有更高体积的生长培养基表面积比（5 mL/cm2 与 G-Rex10 的 4 mL/cm2 相比）。

在 G-Rex100 中以与G-Rex10。正如预期的那样，捐赠者在 G-Rex100s 中表现出强大的扩张动力学。早在容器接种后 48 小时就检测到细胞密度增加，最终扩增动力学略高于在 G-Rex10s 中观察到的。

在 XViVo-15 + 5% HS 中扩增的供体表现出50.64 ± 5.52 倍扩展。在 OptiPEAK T 淋巴细胞中扩增的细胞略高，扩增倍数为 57.81 ± 9.10（图 2）。

图2化学成分确定的培养基OptiPEAK T淋巴细胞在G-Rex100中的扩增动力学比较XViVo-15+5% HS。

细胞表型

通过流式细胞术获得扩增的细胞产物的表型。总 CD3、CD4 和 CD8 w作为测量。正如预期的那样，发现两种培养基之间扩增细胞产物的 CD4/CD8 比率因供体而异。然而，两种培养基的扩增细胞产物的 CD4/CD8 比率没有显着差异（表 1 和图 3）。

表 1 两种媒体类型的 CD4 和 CD8 细胞表型数据。图 3 CD4 和 CD8 比率的代表性流式细胞术面板。收获在 G-Rex 中扩增的细胞并分析 CD3+CD4+ 和 CD3+CD8+ 细胞含量。总体而言，在 OptiPEAK 中扩增的细胞显示出更高程度的 CD3 纯度 (66.85 ± 0.9% 对比 43.6 ± 14.4%)。确定了 CD4 和 CD8 的比率，并显示了代表性供体。汗衫 (E1) 用于分析。进一步门控 CD3+ 细胞以评估 CD4 和 CD8 反应性程度。显示了 XViVO (D1 XV) 的供体和 OptiPEAK (D1 OP) 中的同一供体。

讨论

G-Rex 的使用在临床制造环境中提供了多种好处，可快速和 T 细胞的稳健生产。这些容器提供大的介质容纳能力，以最大限度地减少扩展过程中的进料。此外，这些容器占地面积小，与标准组织培养孵化器兼容，可简化实施。然而，目前用于 G-Rex 的大多数 T 细胞扩增培养基仍然依赖于人血清或血清衍生成分（例如白蛋白和转铁蛋白）来实现商业上可行的扩增动力学。

去除血清或血清衍生成分在制造环境中必不可少，因为病原体污染的风险、高需求和全球供应有限导致的供应链限制，以及由于在血清中观察到的不同程度的成分而导致细胞产品意外变化的风险。 6 目前，监管机构鼓励使用非动物来源的...和 G-Rex 容器中的扩展协议。使用化学成分确定的培养基没有观察到表型变化，这表明重组蛋白可以实现与 T 细胞等效的功能。

这些观察结果证明了 G-Rex 中化学成分确定的 T 细胞扩增过程的原理可以从该过程中消除血清和血液衍生成分。

查看 PDF HereFootnotesXiao L, et al. \"大型 sc在 G-Rex 血管中用工程化的 K562 饲养细胞扩增 Vγ9Vδ2 T 细胞及其作为嵌合抗原受体修饰效应细胞的用途。细胞疗法, 20(3): 420-435, 2018.Grau-Vorster M, et al. \"通过快速和可扩展的生产过程获得的用于过继免疫疗法的巨细胞病毒特异性 T 淋巴细胞产品的特征。” Front Immunol, 25;11:271, 2020.Miyamura M, et al. \"商业制剂中人血清白蛋白翻译后修饰和功能损伤的比较。” J Pharm Sci, 105, 3: 1043-1049, 2016.Pennybaker A, A. R.\"重组白蛋白在人类 T 淋巴细胞扩增中的应用。” Cell Gene Ther Insights, 4, 4:231-239, 2018.Zhang D., et al. \"水稻 (Oryza sativa L.) 重组人血清转铁蛋白转铁蛋白受体介导的内吞作用和细胞铁传递的表征。” BMC Biotechnol, 12: 92, 2012van der Valk J, et al. \"胎牛血清（FBS）：过去-现在-富途关于。” ALTEX, 35(1)99:118, 2018开始新搜索快速搜索链接应用：

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