Recombinant Human ACE2-His-Avi Protein (rhACE2-His)
Source: recombinant human ACE2 protein (Gln18-Ser740) was expressed in mammalian cells with a His tag and Avi at the C-terminus.Accession: Q9BYF1Predicted molecular mass: 86.5 kDa. Due to glycosylation, the recombinant human ACE2 protein migrates to 95-110 kDa based on the Bis-Tris PAGE result.Endotoxin: Less than 1 EU per ug by the LAL method.Formulation: The recombinant human ACE2-His-Avi protein was lyophilized from 0.22 um filtered solution in 20 mM PB (pH 7.4). Normally 5% trehalose is added as protectant before lyophilization.Purity: > 95% by PAGE under reduced condition, and SEC-HPLC.Shipping: The product is shipped with ice packs. Upon receipt, store it immediately at the temperature recommended below.Stability & Storage:Use a manual defrost freezer and avoid repeated freeze-thaw cycles.12 months from date of receipt, -20 to -70°C as supplied.1 month, 2 to 8°C under sterile conditions after reconstitution.3 months, -20 to -70°C under sterile conditions after reconstitution.
Background
ACE2 (Angiotensin I Converting Enzyme 2) belongs to the angiotensin-converting enzyme family of dipeptidylcarboxydipeptidases and has considerable homology to human angiotensin 1 converting enzyme. This secreted protein catalyzes the cleavage of angiotensin I into angiotensin 1-9, and angiotensin II into the vasodilator angiotensin 1-7. The SARS-CoV and SARS-CoV-2 (2019-nCoV) spike (S) proteins mediate viral entry into host cells by binding to a host receptor, ACE2, through the receptor-binding domain (RBD) of the S1 subunit, and then fusing the viral and host membranes through the S2 subunit.
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1． 37℃水浴预热培养液（HUVEC-004）。
2． 从液氮中取出HUVEC的细胞管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 用75%的酒精擦拭产品管外壁。
3． 将HUVEC的细胞管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃ 基础培养液（HUVEC-004B）培养液4－5ml混匀，边加边摇匀。
4． 用1ml的培养液冲洗HUVEC的细胞管，向15ml离心管中加入冲洗的细胞悬液，边滴加边摇匀。
5． 取10μl细胞悬液和10μl台盼蓝混匀后，取10μl计数。
这一步骤非常重要，能确定您收到的产品是否合格（详见如何计数复苏的细胞）
6． HUVEC的细胞悬液在1500rpm，室温条件下，离心10分钟，去除上清。
7． 加HUVEC完全培养液4－5ml, 轻轻混匀细胞，备用。
8． 接种前将 T25培养瓶中的包被液吸去，按2500－5000个细胞/cm2接种细胞。（1支冷冻的细胞可以种一瓶T25培养瓶）
9. 每个HUVEC的细胞培养瓶中加完全培养液（HUVEC-004）3-5ml, 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 （一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。向左转|向右转
最近与战友们探讨原液冻存的问题，各家做的五花八门，做法各不相同。
有的-20度冻存的（有的项目有问题，有的没问题）、有-35度冻存的，有-60度冻存的，有-80度冻存的。
冻存的因素：冻存温度，这个文献等于没说（依据是啥，@fjj8802战友说低于玻璃化转变温度，是否还有别的考虑）、冷冻速率（快，快到什么程度），冻时间（完全冻上，这个貌似需要估计吧，尤其是大量的，如何靠小模型能看出来）、融化温度、融化速率（搅拌）、规模（这个还真不好靠模型来评估）。评估如何来评估冻存的质量好坏，有人说冻融循环，这个小模型适合看蛋白是否对冻融敏感，但是不能很快知道这个蛋白长期冻存的稳定问题。
开本帖探讨原液冻存的注意事项及依据，战友们也可以谈谈自己家目前的做法。
链接：
//d.dxy.cn/detail/12769151
回复：【求助】蛋白制剂处方筛选及稳定性研究参考书，求电子的-蚂蚁淘论坛
CurrentPerspectivesonStABIlityofProteinDrugProductsduringFormulation,FillandFinishOperations.pdf(235.33k)
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。
2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3. 注意冷冻保护剂之品质，冻存液：10%DMSO+90%FBS,我做细胞试验从不加双抗，NAHCO3-未加
4. 冷冻保存的细胞浓度：
冻存方法
1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
2.收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 离心速度不要大于1000rpm/min或800g/min。
3.离心弃上清，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混匀，分装于无菌冻存管中，1 ml/vial，悬浮细胞可以浓一些。
4.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。 或4 oC 1h→ -20 oC 1h→ -80 oC 1h(或隔夜) → 液氮槽vapor phase
最常见的我的k562细胞就是这样做的。
阳离子脂质体法 ：稳定转染,瞬时转染,所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用。
阳离子聚合物 ：稳定转染,瞬时转染,所有细胞。除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。
各位大神们，我的课题实验需要提取临床患者抗凝外周血的血浆进行冻存和后续研究，由于血样珍贵，老板让我把离心提取血浆之后所剩的沉淀也加以利用，从剩下的沉淀（血细胞）当中提取出白细胞并冻存，用于之后做western。我用自己的外周血标本试做了一下，5mlEDTA抗凝外周血，3000rpm4℃离心10min后，取上层血浆分装-80冻存用于相关ELAISA实验，然后在下层沉淀（血细胞）中加入3倍体积的溶血剂，静置10min使红细胞裂解之后离心，结果并没有明显的分层，我重复了加溶血剂裂解红细胞并离心的步骤，到最后的结果还是只能达到如图所示。可以看到一层灰白色物质，但无法完全分离提取白细胞，所以想请教各位大神：①我的操作中有哪些错误烦请大家指出；②我用的溶血剂是OptilyseC的溶血剂，是否是试剂的问题？是否需要购买专门的红细胞裂解液，或者自行配制？③为什么裂解红细胞之后分层并不明显，多次离心之后还是分不清楚？④如果可以提取出白细胞，是否可以直接加入冻存液将白细胞-80℃冻存用于之后的研究（主要是Western，不影响细胞内蛋白即可）？因为是第一次做实验，血样珍贵，这种处理方法做过的人也很少，烦请有经验的各位批评指正，向大家虚心请教学习，不胜感激！
我用bioteke的中量全血基因组DNA提取试剂盒（溶液型）提取冻存全血DNA：蛋白质沉淀液处理后上清呈褐色或淡红色，不是无色；在加入异丙醇后是褐色或淡红色絮状沉淀，不是白色絮状DNA沉淀。
我是参照试剂盒说明一步一步来的，请问这是什么原因？
是不是溶血啦，还是蛋白质没有沉淀完全，如何解决这一问题？
感谢啦！
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