Recombinant Human ACE2-His-Avi Protein (rhACE2-His)
Source: recombinant human ACE2 protein (Gln18-Ser740) was expressed in mammalian cells with a His tag and Avi at the C-terminus.Accession: Q9BYF1Predicted molecular mass: 86.5 kDa. Due to glycosylation, the recombinant human ACE2 protein migrates to 95-110 kDa based on the Bis-Tris PAGE result.Endotoxin: Less than 1 EU per ug by the LAL method.Formulation: The recombinant human ACE2-His-Avi protein was lyophilized from 0.22 um filtered solution in 20 mM PB (pH 7.4). Normally 5% trehalose is added as protectant before lyophilization.Purity: > 95% by PAGE under reduced condition, and SEC-HPLC.Shipping: The product is shipped with ice packs. Upon receipt, store it immediately at the temperature recommended below.Stability & Storage:Use a manual defrost freezer and avoid repeated freeze-thaw cycles.12 months from date of receipt, -20 to -70°C as supplied.1 month, 2 to 8°C under sterile conditions after reconstitution.3 months, -20 to -70°C under sterile conditions after reconstitution.
Background
ACE2 (Angiotensin I Converting Enzyme 2) belongs to the angiotensin-converting enzyme family of dipeptidylcarboxydipeptidases and has considerable homology to human angiotensin 1 converting enzyme. This secreted protein catalyzes the cleavage of angiotensin I into angiotensin 1-9, and angiotensin II into the vasodilator angiotensin 1-7. The SARS-CoV and SARS-CoV-2 (2019-nCoV) spike (S) proteins mediate viral entry into host cells by binding to a host receptor, ACE2, through the receptor-binding domain (RBD) of the S1 subunit, and then fusing the viral and host membranes through the S2 subunit.
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1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 （一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。向左转|向右转
做ELISA实验，在处理样本前应该先了解收集样本的注意事项。
【标本收集注意事项】
1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2.血清和血浆避免使用溶血，高血脂标本。
3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4.标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃电冰箱内，避免反复冻融。
5.可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) 。
6.收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误实验进程。
7.收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜等），认为所有标本都具有一定的潜在危险性。
8.样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。
样本正确的处理方法应该是这样的：
【标本处理办法】
1.血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
2.血浆：用EDTA，枸橼酸钠，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm离
心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）
保存。
3.组织匀浆：切取组织块，0.01MPBS中过洗一次；按照1G组织加入5-10ml组织蛋白萃取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
4.细胞培养上清：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
5.尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃3-6个月）保存。
注：样品稀释的一般原则
用户须查阅相关文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。样品的稀释应有详细记录。
希望可以给您提供帮助，祝您科研顺利！
最近与战友们探讨原液冻存的问题，各家做的五花八门，做法各不相同。
有的-20度冻存的（有的项目有问题，有的没问题）、有-35度冻存的，有-60度冻存的，有-80度冻存的。
冻存的因素：冻存温度，这个文献等于没说（依据是啥，@fjj8802战友说低于玻璃化转变温度，是否还有别的考虑）、冷冻速率（快，快到什么程度），冻时间（完全冻上，这个貌似需要估计吧，尤其是大量的，如何靠小模型能看出来）、融化温度、融化速率（搅拌）、规模（这个还真不好靠模型来评估）。评估如何来评估冻存的质量好坏，有人说冻融循环，这个小模型适合看蛋白是否对冻融敏感，但是不能很快知道这个蛋白长期冻存的稳定问题。
开本帖探讨原液冻存的注意事项及依据，战友们也可以谈谈自己家目前的做法。
链接：
//d.dxy.cn/detail/12769151
回复：【求助】蛋白制剂处方筛选及稳定性研究参考书，求电子的-蚂蚁淘论坛
CurrentPerspectivesonStABIlityofProteinDrugProductsduringFormulation,FillandFinishOperations.pdf(235.33k)
1． 37℃水浴预热培养液（HUVEC-004）。
2． 从液氮中取出HUVEC的细胞管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 用75%的酒精擦拭产品管外壁。
3． 将HUVEC的细胞管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃ 基础培养液（HUVEC-004B）培养液4－5ml混匀，边加边摇匀。
4． 用1ml的培养液冲洗HUVEC的细胞管，向15ml离心管中加入冲洗的细胞悬液，边滴加边摇匀。
5． 取10μl细胞悬液和10μl台盼蓝混匀后，取10μl计数。
这一步骤非常重要，能确定您收到的产品是否合格（详见如何计数复苏的细胞）
6． HUVEC的细胞悬液在1500rpm，室温条件下，离心10分钟，去除上清。
7． 加HUVEC完全培养液4－5ml, 轻轻混匀细胞，备用。
8． 接种前将 T25培养瓶中的包被液吸去，按2500－5000个细胞/cm2接种细胞。（1支冷冻的细胞可以种一瓶T25培养瓶）
9. 每个HUVEC的细胞培养瓶中加完全培养液（HUVEC-004）3-5ml, 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
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