月黑风高夜，四下无人时，实验大楼在月光的映照下显得格外素净。

突然，只听楼里传来一阵哀嚎：「我掏心掏肺地对你们好，你们却如此狠心，离我而去。」寻声望去，只见一位白衣男子，蹲坐在地，抱着培养基哭泣。

额，原来是细胞又养死了。。。

面对日日夜夜精心培养的细胞撒手而去，有如此反应也不为过。如何让这群金贵的小家伙「长命百岁」，是让科研人深思的问题。

正所谓：知其死，方能知其何以生。那么接下来就让我们追根溯源，聊一聊细胞凋亡的那些事。（文末彩蛋，可免费申请凋亡检测试剂盒）

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是为维持内环境稳定，在一定时间内，细胞按一定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时空性和选择性。

与细胞坏死不同，它不是病理条件下的自体损伤，而是为更好地适应生存环境主动争取的一种死亡过程。凋亡缺陷会导致肿瘤等细胞死亡障碍疾病的发生，在某些情况下如心脏受袭也会导致凋亡过激从而杀死许多无辜细胞。

细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控等，其特征在于质膜不对称性和附着的丧失，核质浓缩，核膜、核仁碎裂，DNA 片段化和 mRNA 衰变等，早期特征之一是质膜的改变。

细胞凋亡普遍存在于人类及多种动、植物中，是多细胞生物个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中。

凋亡可被多种细胞信号激活，如钙稳态失衡、氧化损伤、线粒体损伤、毒素、生长因素和激素刺激等。细胞凋亡过程大致分为：凋亡信号转导→凋亡基因激活→细胞凋亡的执行→凋亡细胞的清除。经典的细胞凋亡机制可分为内源性信号通路和外源性信号通路两种。

内源性凋亡信号通常激活线粒体途径。凋亡蛋白 Bid 诱导凋亡蛋白 Bcl-2 拮抗剂 Bak 和 Bcl-2 结合蛋白 Bax 的激活，它们形成的聚合体插入线粒体外膜引起膜电位下降和细胞凋亡关键蛋白的释放，如细胞色素 C、SMAC / DIABLO 及凋亡诱导因子（AIF）等，激活 Caspase 级联反应，从而诱发细胞凋亡。

外源性死亡受体途径开始于特异性死亡受体与配体结合，如 FasL（CD95）或 TNFR1 分别和配体 Fas 或 TNF-α 结合，使死亡受体的结构域寡聚化，后募集 Caspase-8 和衔接蛋白 FADD 形成死亡诱导信号复合体 DISC。激活的 Caspase-8 引发后续 Caspase 级联反应促进细胞死亡，它还能与 Bid 相互作用激活内源性通路。

细胞生命的终结有许多种方式，凋亡只是其中一种，所以要确保自己检测到的的确是凋亡信号。

细胞凋亡的检测方法也有多种，如形态学检测、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法）、线粒体膜势能检测、DNA 片断化检测、TUNEL 法及 Caspase-3 活性检测等，可根据自己的实验需求选择合适的方法。这里我们主要了解 Annexin V 法。

Annexin V 是一种分子量为 35～36 KD 的丰富的胞内蛋白。Annexin V 属于 Ca2+结合蛋白家族，可与磷脂（PL）发生可逆的 Ca2+ 依赖性结合，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高亲和力。在健康细胞中，PS 主要位于质膜的胞质侧，而在早期凋亡细胞中，PS 从质膜内侧翻转至外侧，Annexin V 与暴露在细胞外环境的 PS 结合。

核酸染料碘化丙啶（PI）及 7 氨基-放线菌素 D（7-AAD）均具有高 DNA 结合常数，它们不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染色。因此，将 Annexin V 与 PI 或 7-AAD 联合使用，可以将凋亡早、晚期的细胞以及死细胞区分开来。

Annexin V 可以与荧光素（FITC、PE）或 biotin 缀合，这种形式保留了 Annexin V 对 PS 的高亲和力，因此可以用流式细胞术或荧光显微镜检测细胞凋亡的发生。与 PI 不同，7-AAD 与 PE 和 FITC 的光谱重叠最小，因此，可以在多色分析中与 PE 和 FITC 标记的抗体联合使用。

图 1. Annexin V/7-AAD 凋亡检测原理示意图

以 7-AAD 为例（见上图），在早期细胞凋亡中，用 Annexin V 染色可以区分早期凋亡细胞（Annexin V 阳性，7-AAD 阴性）。在晚期细胞凋亡中，细胞膜丧失完整性，7-AAD 可以与 DNA 结合（Annexin V 阳性，7-AAD 阳性）。

然而，该方法不能区分凋亡细胞和坏死细胞，在任一情况下，死细胞都会被 Annexin V 和 7-AAD 染色。

细胞凋亡与疾病发生存在密切的关系，细胞凋亡不足或过度均会导致一系列疾病。如，肿瘤细胞凋亡抑制基因或凋亡活化基因表达异常，细胞死亡不足会导致肿瘤发生；负选择机制失调，针对自身抗原的 T 细胞未能通过细胞凋亡而被清除，进而攻击自身组织，产生自身免疫病（如系统性红斑狼疮）。

细胞凋亡过度可导致心血管疾病、神经元退行性疾病及病毒感染（如 AIDS，某些 T 细胞过度凋亡）等疾病的发生。

细胞凋亡不足与过度并存也可引起一系列疾病，如动脉粥样硬化时，内皮细胞凋亡过度，平滑肌细胞凋亡不足等。所以，加强对细胞凋亡的检测在临床疾病检测与治疗中具有重要意义。

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文章来源：义翘神州

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