细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
凋亡产生的过程会伴随有很多特征，比如DNA含量减少，线粒体膜电位丢失，细胞膜磷酯酰丝氨酸膜外翻等。以上每种表现都可以通过灵敏、特异的流式染料和试剂进行检测。
eBioscience为我们提供了完整的检测方案。而且现如今越来越多研究更加关注于某群细胞的凋亡现象，那么流式染色的方案又该如何设计呢？

今天让我们来揭晓这个答案：

1.线粒体膜电位JC-1方法

线粒体电化学势梯度(ΔΨ)丧失是凋亡早期的事件。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential)△Ψm的理想荧光探针，可以用于检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
CCCP(carbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone)可用于研究线粒体膜电位。JC-1在线粒体中的积聚依赖于电位，其发射光从绿色(~529nm)迁移到红色(~590nm)。因此，线粒体去极化时，红色/绿色荧光强度之比会下降。JC-1在多种类型的细胞包括肌细胞和神经元，以及完整的组织和分离的线粒体中都可以作为线粒体膜电位的指示剂。

2.AnnexinV方法；

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

因此，将AnnexinV与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞（AnnexinV-/PI-）和早期凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性（AnnexinV+/PI+）。

2.1AnnexinV-PI/7-AAD染色步骤

2.2AnnexinV-FixableViABIlityDyes-可固定的死活细胞染料

2.3AnnexinV-表面/胞内染色步骤

详细步骤可参考附件文件。

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