EpiOcular’sstrongcorrelationtohistoricalinvivodatasetsandexceptionalreproducibilitymakeitanidealmodelfortheocularsafetytestingofrawingredientsandfinalformulations. TheEpiOcularEyeIrritationTest(EIT)isaninvitroalternativetoanimaltestingandisavalidated,OECDtestguideline(TG492). EpiOcularhasbeenusedformanyyearsbyindustryasanon-animal,invitroalternativetodetermineDraizescores(forwatersolubletestarticles)andtoassessthemildness/ultra-mildness(sub-Draize)ofmaterialscontactingtheeyes.
Technology:
EpiOculareyeirritationassayshavebeenincorporatedintotoxicologylaboratoriesacrosstheworld.Withstraightforwardprotocolsandsimpleyethighlypredictiveendpoints,EpiOcularassaysareroutinelyutilizedthroughoutthecosmetic,personalcare,chemicalandpharmaceuticalindustries.Developedmorethan20yearsago,EpiOcularhasbeenusedfortestingthousandsofmaterials.Whetherscientistsneedariskassessmentassayfortheirritationpotentialofanoculardeliveredmaterialorthehazardassessmentofchemicalbeingtransportedacrosstheworld,EpiOcularisthetestsystemofchoicetomeetyouroculartestingneeds.
Applications:
OcularIrritationTests
EpiOcularEyeIrritationTest
TheEpiOcularEITisaninvitrohazardassessmentassaythathastheABIlitytodifferentiatematerialsthatareocularnon-irritantsfrommaterialsthatarenotocularirritants.TheEITisapplicabletoabroadrangeoforganicandinorganicchemicals,andisacceptedasOECDTG492.
EpiOcularEyeIrritationTestProtocol
WatchavideobyJoveonEpiOcularEIT
EpiOcularSubDraizeUltra-MildnessTest
TheEpiOcularUltra-mildnessTestisaninvitroriskassessmentassayroutinelyutilizedformildmaterialsforwhichtheDraizetestisinsensitive.ThishighlyreproducIBLeassayallowsforquantifiablediscriminationamongmild,milderandmildestproductformulations.
EpiOcularSubDraizeProtocol
EpiOcularMTTET-50(Neat)
Thisinvitroriskassessmentassayisbasedontheeffectivetimeatwhichamaterial(appliedneat)causesa50%reductionintissueviability(ET-50).BasedontheET-50,thetestarticleiscategorizedintooneof4classificationsrangingfromnon-irritatingtosevere/extremewhichcorrespondtogroupingsofRabbitDraizeEyeScores(MMAS).
EpiOcularMTTET-50NeatProtocol
EpiOcularMTTET-50(Dilution)
SimilartotheMTTET-50Neatmethod,thisinvitroriskassessmentassayisbasedontheeffectivetimeatwhichamaterial(dilutedto20%inwater)causesa50%reductionintissueviability(ET-50).BasedontheET-50,thetestarticleiscategorizedintooneof4classificationsrangingfromnon-irritatingtosevere/extremewhichcorrespondtogroupingsofRabbitDraizeEyeScores(MMAS).Thismethodisrecommendedforsurfactantbasedsolutionsandisapplicabletowater-solublematerialswithaspecificgravityof>0.95.
EpiOcularMTTET-50DilutionProtocol
BrowseourreferencelibrarytoseehowourEpiOculartissuehasbeenusedintheseareasofstudy.
TechSpecs:
Tissue:
Kit:StandardEpiOcular™kit(OCL-200)consistsof24tissues,eachtissue9mmindiameter.(Tissue“kits”containtissues,asmallamountofculturemedium,andplasticware;contactMatTekforspecifickitcontents.)
Substrate:Non-coated,9mmIDsinglewelltissuecultureplateinsertsareused(e.g.MillicellPCF,Nuncpolycarbonatesinglewelltissuecultureplateinserts).
Culture:Atairliquidinterface.
Histology:5-8celllayers(basallayertoapicalsurface).
Cornification:None.
LotNumbers:Tissuelotsproducedbyeachtechnicianforeachweekareassignedaspecificlotnumber.Typically,therearemultiplelotnumbersforanygivenweek’stissueproduction.Aletterofthealphabetisappendedtotheendofthelotnumbertodifferentiatebetweenindividualkitswithinagivenlotoftissues.Alltissuekitswithinalotareidenticalinregardstocells,medium,handling,cultureconditions,etc.
Shipment:At4°Conmedium-supplemented,agarosegelsin24-wellplate.
Shipmentday:EveryMonday.ShipmentonThursdayalsopossibleuponspecialrequest.
Delivery:TuesdaymorningviaFedExpriorityservice(US).OutsideUS:Tuesday-Thursdaydependingonlocation.
Shelflife:Includingtimeintransit,tissuesmaybestoredat4°Cforupto4dayspriortouse.However,extendedstorageperiodsarenotrecommendedunlessabsolutelynecessary.Inaddition,thebestreproducibilitywillbeobtainediftissuesareusedconsistentlyonthesameday,e.g.Tuesdayafternoonorfollowingovernightstorageat4°C(Wednesdaymorning).
Alternativetissues:
OCL-200-ABF:Antibiotic-freetissue.Forlast3daysofculture,gentamicinisomittedfromculturemedium.Customerreceives200mlofOCL-200-ASY-AFABmedium.
OCL-200-AFF:Anti-fungal-freetissue.Forlast3daysofculture,Amphotericinisomittedfromculturemedium.Customerreceives200mlofOCL-200-ASY-AFABmedium.
OCL-200-AFAB:Antibiotic,anti-fungal-freetissue.Forlast3daysofculture,gentamicinandAmphotericinareomittedfromculturemedium.Customerreceives200mlofOCL-200-ASY-AFABmedium.
OCL-200-EACH:SingleEpiOculartissueinsert.
OCL-200-FRZN-EA:SingleOCL-200tissuethathasbeensubjectedto3freeze/thawcycles.DesignedtoserveascontrolforMTTauto-reductiontest.
OCL-212:Halfkit(12culturesinsteadofstandard24).
OCL-606:SameasOCL-200except6tissuesperkit,eachtissueculturedinalargercellcultureinsert(22mmdiameter).
Cells:
Type:Normalhumanepidermalkeratinocytes(NHEK).
Geneticmake-up:Singledonor.
Derivedfrom:Neonatal-foreskintissue.
Screenedfor:HIV,Hepatitis-B,Hepatitis-C,mycoplasma.
Medium:
Basemedium:Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM).
Growthfactors/hormones:Epidermalgrowthfactor,insulin,hydrocortisoneandotherproprietarystimulatorsofnon-keratinizingepithelialdifferentiation.
Serum:None.
Antibiotics:Gentamicin5µg/ml(10%ofnormalgentamicinlevel).
Anti-fungalagent:AmphotericinB0.25µg/ml.
pHIndicator:Phenolred.
Alternatives:Phenolred-free,antibiotic-free,anti-fungal-free,orhydrocortisone-freemediumandtissueareavailable.Agentsareremovedatleast3dayspriortoshipment.
Maintenancemedium:MostassayswithEpiOcular™areperformedwithin24hours.However,forlongerexperiments,thetissuecanbemaintainedinOCL-200-MM(identicaltoEpiOcular™assaymedium).
QualityControlandSterility:
Visualinspection:Alltissuesarevisuallyinspectedandifphysicalimperfectionsarenoted,tissuesarerejectedforshipment.
End-usetesting:Tissuesareexposedto0.3%TritonX-100for5,20,and60minutes.Thetimeofexposurerequiredtoreducethetissueviability(ET-50)usingtheMTTassayisdetermined(SeeMatTekEpiOcularTMET-50protocol)foreachlotoftissue.ET-50’smustfallwithintherangeofthe1996EpiOcular™database:12.2-37.5minutes.ET-50’sincustomers’labsareoftenverysimilartoMatTekresults.
Sterility:Allmediausedthroughouttheproductionprocessischeckedforsterility.Maintenancemediumisincubatedwithandwithoutantibioticsfor1weekandcheckedforsterility.Theagarosegelfromthe24-wellplateusedforshippingisalsoincubatedfor1weekandcheckedforanysignofcontamination.
Screeningforpathogens:AllcellsarescreenedandarenegativeforHIV,hepatitisBandhepatitisCusingPCR.However,noknowntestmethodcanoffercompleteassurancethatthecellsarepathogenfree.Thus,theseproductsandallhumanderivedproductsshouldbehandledatBSL-2levels(biosafetylevel2)orhigherasrecommendedintheCDC-NIHmanual,“BiosafetyinmicroBIOLOGicalandbiomedicallaboratories,”1998.Forfurtherassistance,pleasecontactyoursiteSafetyOfficerorMatTektechnicalservice.
Notificationoflotfailure:IfatissuelotfailsourQCorsterilitytesting,thecustomerwillbenotifiedandthetissueswillbereplacedwithoutcharge.BecauseourQCandsterilitytestingisdonepost-shipment,notificationwillbemadeassoonaspossible(Undernormalcircumstances,ET-50failureswillbenotifiedbyWednesday5pm;sterilityfailureswillbenotifiedwithin8daysofshipment).
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
方式：真核生物的分裂依据过程不同有三种方式，有有丝分裂，无丝分裂，减数分裂。其中有丝分裂是人、动物、植物、真菌等一切真核生物中的一种最为普遍的分裂方式，是真核细胞增殖的主要方式。减数分裂是生殖细胞形成时的一种特殊的有丝分裂。向左转|向右转
减数分裂也是真核生物细胞增殖的方式之一。
真核生物细胞增殖的方式有：有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。
细胞分裂间期分为G1期S期和G2期 G1期的特点：G1期是从上次细胞增殖周期完成以后开始的。G1期是一个生长期。在这一时期主要进行RNA和蛋白质的生物合成，并且为下阶段S期的DNA合成做准备。如合成各种与DNA复制有关的酶，线粒体、核糖体等都增多了
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
①持续分裂细胞,又称周期性细胞, 即在细胞周期中连续运转的细胞。机体内某些组织需要不断的更新,组成这些组织的细胞就必须通过不断分裂产生新细胞。此类细胞的分裂周期非常正常, 有丝分裂的活性很高。如性细胞(包括卵母细胞和精原细胞),它们要不断地产生配子; 造血干细胞需要不断地产生红细胞和白细胞;上皮基底层细胞需要通过分裂不断补充表面老化死亡的细胞; 植物的根茎尖端细胞需要通过分裂进行生长等都是具有正常周期的持续分裂细胞。
②终端分化细胞, 即永久性失去了分裂能力的细胞，它们不可逆地脱离了细胞周期, 但保持了生理活性机能。这些细胞都是高度特化的细胞, 如哺乳动物的红细胞、神经细胞、多形性白细胞、肌细胞等, 这些细胞一旦分化,就永远保持这种不分裂状态直到死亡。
③G0细胞,又称休眠细胞，暂时脱离细胞周期,不进行DNA复制和分裂, 也称静止细胞群。但这些细胞可在某些条件的诱导下重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。如肝细胞, 外科手术切除部分肝组成后可以诱导进入细胞分裂。淋巴细胞可通过与抗原的相互作用诱导增殖。在胚胎发育早期(卵裂期)，所有的细胞均为周期性细胞, 以后随着发育成熟, 某些细胞进入了GO期, 某些细胞分化后丧失分裂能力。到成体时,只有少数细胞处于增殖状态, 它们的增殖仅作为补充丢失的细胞, 或对外界刺激的反应。
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。向左转|向右转
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
1，如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10Mm的话，将会100%抑制。
2，CCK-8试剂的保存条件？
在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
3，预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
4，CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
5，悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
6，应该每次做标准曲线吗？
建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
7，有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
8，实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
9，如果OD值太低，可以采取什么办法？
可以采取2个办法：①适当增加细胞数量。②延长加入CCK-8试剂后的染色时间。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。
1，CCK-8能否对活细胞进行染色？
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
2，CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
3，在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
4，每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
5，如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。
6，哪些物质会影响CCK8的测定？
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
7，在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
8，设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
9，说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
10，在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
有一下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
11，必须预培养细胞吗？
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
