要用AnnexinV双染法测凋亡,又想同时标记蛋白Marker,甚至还有胞内指标,可是PI和7-AAD都不能洗,怎么办?
eBioscience的可固定细胞活力染料FixableViABIlityDye帮您完美解决
固定、破膜以及洗涤步骤不影响FixableViabilityDye的染色,而PI、7-AAD的染色通常是放在其他抗体孵育完成后进行,不能洗涤即要上机检测;对于胞内抗体的染色,由于经过了固定步骤,经过PI或7-AAD染色后所有的细胞都是阳性,所以他们只适合于胞膜染色的死活细胞鉴定。
试剂
◎AnnexinVApoptosisDetectionkit(Cat.No.88-8007,88-8006,88-8005,88-8102,or88-8008)
◎10XBindingbuffer
◎AnnexinconjugatedtoAPC,eFluor450,FITC,PEorPerCP-eFluor710
◎FixableViabilityDyeeFluor®660(Cat.No.65-0864),FixableViabilityDyeeFluor®506(Cat.No.65-0866)orFixableViabilityDyeeFluor®780(Cat.No.65-0865)
注意:FixableViabilityDyeeFluor®450不推荐与AnnexinV检测试剂盒同时使用
◎Foxp3StainingBufferSet(Cat.No.00-5523)
◎FlowCytometryStainingBuffer(Cat.No.00-4222)
◎PBS(azide-andserum/protein-freePBS)
实验方法
1.用蒸馏水稀释10XBindingBuffer至1X;
2.标记表面marker;
3.用不含叠氮钠及血清的PBS洗细胞两次;
4.在不含叠氮钠及血清的PBS按1-10x106cells/mL的浓度重悬细胞;
5.每1mL细胞中加入1μLofFixableViabilityDye并立即涡旋混匀;
6.2-8°C避光孵育30分钟;
7.孵育完成后,务必用含蛋白的缓冲液,如FlowCytometryStainingBuffer洗两次细胞;
8.用1XBindingBuffer洗一次细胞;
9.在1XBindingBuffer中按1-5x106cells/mL浓度重悬细胞;
10.100μL细胞悬液中加入5μL荧光标记的AnnexinV;
11.室温避光孵育10-15分钟;
12.用1XBindingBuffer洗细胞一次;
13.固定破膜,用破膜缓冲液洗细胞;
注意:此时已经不需要保持缓冲液中的钙离子,因为AnnexinV已经结合到细胞表面了
14.进行胞内marker的标记;
15.完成后上机分析。
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FixableViabilityDye可固定的死活细胞鉴定染料eBoscience