MakeyourtargetspecificgRNAlentivectorswithdesiredMarkers!
pLenti-gRNA-U6/H1- CloningKitisdesignedfor cloningofdouble-strandDNAencodingyourdesired gRNAsequenceforCRISPRgenomicgeneediting.Oncetranscribed,thetargetspecificgRNAwillguildCAS9enzymetocutthegenomicDNAatdesiredloci.
TomakeyourtargetspecificgRNAlentivector,twosyntheticgRNAoligonucleotidesare firstannealedtoformthedoublestandDNAduplexwhichis thenclonedintotheprovided,linearpLenti-gRNA-U6 /H1lentivectorviaT4enzymeligation.
ProductFeatures:
1)Flexibility toselectdesiredpromoter: H1orU6;
2)Flexibilitytochoose desired selectionmarker:antibioticorantibiotic-fluorescentfusiondualmarker;
3)Easyandhighefficiencycloningreaction:withprovidedpre-cut,readytouse,lineargRNAlentivector,youdoNOTneedthetedious,yetoftentroublesomelentivectorbackbonepreparation.TheCloningpositiveratecloseto100%.
4)Everythingisincludedinthiskit,enoughforgenerating10gRNAlentivectors;
5)OptionallyusedastetracyclineinducIBLe gRNAtranscription(forH1promoteronly);
ThisproductisthelentivectorversionhavingthegRNAdrivenbyaconstitutivehumanU6 promoter witha RFP-PuromycindualselectionmarkerunderRsvpromoter.PleaseseeProductManualfordetails.
Kitcontents:
pLenti-U6-(RFP-Puro)linearvector: 10ul(10rxn,1ul/rxn)
10xgRNAoligoannealingsolution: 25ul
10Xligationbuffer: 20ul
T4ligaseenzyme: 10ul(10rxn,1ul/rxn)
Cloningcontrolinsert:annealedNeg-gRNAduplex: 10 ul(10rxn,1ul/rxn)
Sequencingprimer: 10ul(10xn,1ul/rxn)DH5achemicalcompetentcells: 10vials(10xn,1vial/rxn)
ThegeneratedgRNAlentivectorcanbeusedfortransfectionorelectroporationbasedCRISPRediting,orusedforgRNAlentivirusproductionandthenusethegRNAlentivirusfor CRISPRediting.
Cat#: gRNA-U6-RP
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
第十二条物制品产环境空气洁净度级别应与产品产操作相适应厂房与设施应原料、间体品造污染
第十三条产程涉及高危操作其空气净化系统等设施应符合特殊要求
第十四条物制品产操作应符合表规定相应级别洁净区内进行未列操作参照表适级别洁净区内进行:
洁净度级别
物制品产操作示例
B级背景局部A级
附录菌药品非终灭菌产品规定各工序
灌装前经除菌滤制品其配制、合并等
C级
体外免疫诊断试剂阳性血清装、抗原与抗体装
D级
原料血浆合并、组离、装前巴氏消毒
口服制剂其发酵培养密闭系统环境(暴露部需菌操作)
酶联免疫吸附试剂等体外免疫试剂配液、装、干燥、内包装
第十五条产程使用某些特定物体阶段应根据产品特性设备情况采取相应预防交叉污染措施使用专用厂房设备、阶段性产式、使用密闭系统等
第十六条灭疫苗(包括基重组疫苗)、类毒素细菌提取物等产品灭交替使用同灌装间灌装、冻干设施每装应采取充污染措施必要应进行灭菌清洗
第十七条卡介苗结核菌素产厂房必须与其制品产厂房严格产涉及物产设备应专用
第十八条致病性芽胞菌操作直至灭程完前应使用专用设施炭疽杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌破伤风梭状芽胞杆菌制品须相应专用设施内产
第十九条其种类芽孢菌产品某设施或套设施期轮换产芽胞菌制品任何间能产种产品
第二十条使用密闭系统进行物发酵同区域同产单克隆抗体重组DNA制品
第二十条菌制剂产加工区域应符合洁净度级别要求并保持相压;操作致病作用微物应专门区域内进行并保持相负压;采用菌工艺处理病原体负压区或物安全柜其周围环境应相压洁净区
第二十二条菌(毒)操作区应独立空气净化系统自病原体操作区空气循环使用;自危险度二类病原体操作区空气应通除菌滤器排放滤器性能应定期检查
第二十三条用于加工处理物体产操作区设备应便于清洁污染清洁污染效性应经验证
第二十四条用于物体培养设备应能够防止培养物受外源污染
第二十五条管道系统、阀门呼吸滤器应便于清洁灭菌宜采用线清洁、线灭菌系统密闭容器(发酵罐)阀门应能用蒸汽灭菌呼吸滤器应疏水性材质且使用效期应经验证
第二十六条应定期确认涉及菌毒种或产品直接暴露隔离、封闭系统泄漏风险
第二十七条产程病原体污染物品设备应与未使用灭菌物品设备并明显标志
第二十八条产程需要称量某些添加剂或(缓冲液)产区域存放少量物料
第二十九条洁净区内设置冷库恒温室应采取效隔离防止污染措施避免产区造污染
面GMP附录3要求关键看体外试剂哪类般没问题
1.相同房间产段产
2.同房间产且使用同空调系统
现在小弟碰见一个难题,我想克隆一个基因,但是我在NCBI一检索,发现别人只发表了这个基因的DNA全长,但是,CDNA没有发表,也没有发表文章,想请问下,在不知道CDNA的情况下,请问我应该如何做这个基因的克隆???(全基因组也不知道,其他生物没有这种基因)
保存条件: 受态细胞要严格-70℃冰存SOC培养基置于2-8℃保存其余试剂于-20℃保存避免反复冻融
2) 克隆技术使用使倾向于量繁殖现种群利用价值体,按自规律促进整种群优胜劣汰.意义说,克隆技术干扰自进化程.
3) 克隆技术种昂贵技术,需要量金钱物专业士参与,失败率非高.莉277实验唯.虽现发展更先进技术,功率能达2-3%.
4) 转基物提高疾病传染风险.例,产药物牛奶牛染病毒,种病毒能通牛奶染病
5) 克隆技术应用于体导致代遗传性状工控制.克隆技术引起争论核能否允许发育初期类胚胎进行遗传操作.伦理家所能接受.
6) 克隆技术用创造超,或拥健壮体格却智力低.且,克隆技术能够类效运用,男性失遗传意义.
7) 克隆技术家庭关系带影响巨.由父亲DNA克隆孩看作父亲双胞胎兄弟,延迟几十已.难设想,发现自另外完全复制品,(或)受
吸附(Adsorption)是指病毒附着于敏感细胞的表面,它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用,这是可逆的联结。随后的特异性吸附是非常重要的,根据这一点可确定许多病毒的宿主范围,不吸附就不能引起感染。
脊髓灰质炎病毒的细胞表面受体是免疫球蛋白超家族,在非灵长类细胞上没有发现此受体,而猴肾细胞、 Hela细胞和人二倍体纤维母细胞上有它的受体,故脊髓来质炎病毒能感染人体鼻、咽、肠和脊髓前角细胞,引起脊髓灰质炎(小儿麻痹)。
水磨石病毒的细胞表面受体是含唾液酸(N-乙酰神经氨酸)的糖蛋白,它与流感病毒表面的血凝素剌突(受体连结蛋白)有特殊的亲和力,如用神经氨酸酶破坏该受体,则流感病毒不再吸附这种细胞。
此外,HIV受体为CD4;鼻病毒的受体为细胞粘附分子-1(1CAM-1);EB病毒的受体为补体受体-2(CR-2)。病毒吸附也受离子强度、pH、温度等环境条件的影响。研究病毒的吸附过程对了解受体组成、功能、致病机理以及探讨抗病毒治疗有重要意义。
(二)穿入(penetration):膜融合;病毒胞饮等
穿入(Penetration)是指病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆,开始病毒感染的细胞内期。
主要有三种方式:(1)融合 (Fusion),在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合,病毒的核衣壳进入胞浆。副粘病毒以融合方式进入,如麻疹病毒、腮腺炎病毒囊膜上有融合蛋白,带有一段疏水氨基酸,介导细胞膜与病毒囊膜的融合。(2)胞饮 (Viropexis),由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡。胞饮是病毒穿入的常见方式,也是哺乳动物细胞本身具有一种摄取各种营养物质和激素的方式。当病毒与受体结合后,在细胞膜的特殊区域与病毒病毒一起内陷形成膜性囊泡,此时病毒在胞浆中仍被胞膜覆盖。某些囊膜病毒,如流感病毒借助病毒的血凝素(HA)完成脂膜间的融合,囊泡内低Ph环境使HA蛋白的三维结构发生变化,从而介导病毒囊膜与囊泡膜的融合,病毒核衣壳进入胞浆。(3)直接进入,某些无囊膜病毒,如脊髓灰质炎病毒与受体接角后,衣壳蛋白的多肽构形发生变化并对蛋白水解酶敏感,病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中,而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外,这种进入的方式较为少见。
(三)脱壳(uncoating):细胞溶酶体酶; 病毒脱壳酶
穿入和脱壳是边续的过程,失去病毒体的完整性被称为“脱壳 (Uncoating)”。脱壳到出现新的感染病毒之间叫“隐蔽期”。经胞饮进入细胞的病毒,衣壳可被吞噬体中的溶酶体酶降解而去除。有的病毒,如脊髓灰质炎病毒,在吸附穿入细胞的过程中病毒的RNA释放到胞浆中。而痘苗病毒当其复杂的核心结构进入胞浆中后,随之病毒体多聚酶活化,合成病毒脱壳所需要的酶,完成脱壳。
(四)生物合成(biosynthesis):病毒核酸复制; 病毒蛋白质合成
DNA病毒和RNA病毒在复制机理有区别,但复制的结果都是合成核酸分子和蛋白质衣壳,然后装配成新的有感染性的病毒。一个复制周期大约需6~8小时。
1. 双股DNA病毒的复制----多数DNA病毒为双股DNA。
双股DNA病毒,如单纯疹病毒和腺病毒在宿主细胞核内的RNA聚合酶作用下,从病毒DNA上转录病毒mRNA,然后转移到胞浆核糖体上,指导合成蛋白质。
1) 病毒基因的mRNA转录(早期转录): 病毒本身含有RNA聚合酶,可在胞浆中转录mRNA。mRNA有二种:早期m RNA,主要合成复制病毒DNA所需的酶及调控蛋白等,如依赖DNA的DNA聚合酶,脱氧胸腺嘧啶激酶等,称为早期蛋白;
2)病毒核酸复制:子代病毒DNA的合成是以亲代DNA为模板,按核酸半保留形式复制子代双股DNA。DNA复制出现在结构蛋白合成之前。
3)晚期转录: 晚期mRNA和晚期翻译:晚期蛋白 --- 衣壳蛋白, 包膜蛋白
晚期mRNA ,在病毒DNA复制之后出现,主要指导合成病毒的结构蛋白,称为晚期蛋白。
2. 单股RNA病毒的复制----RNA病毒核酸多为单股,病毒全部遗传信息均含在RNA中。
又可分为:
病毒RNA的碱基序列与mRNA完全相同者,称为正链RNA病毒。
病毒RNA碱基序列与mRNA互补者,称为负链RNA病毒。
逆转录病毒又称RNA肿瘤病毒 (Oncornavirus) ,病毒体含有单股正链RNA、依赖RNA的DNA多聚酶(逆转录酶)和 tRNA。
(1) 正链RNA病毒的复制 以脊髓灰质炎病毒为例,侵入的RNA直接附着于宿主细胞核糖体上,翻译出大分子蛋白,并迅速被蛋白水解酶降解为结构蛋白和非结构蛋白,如依赖RNA的RNA聚合酶。在这种酶的作用下,以亲代RNA为模板形成一双链结构,称“复制型(Replicative form)”。再从互补的负链复制出多股子代正链RNA,这种由一条完整的负链和正在生长中的多股正链组成的结构,秒“复制中间体(Replicative intermediate) ”。新的子代RNA分子在复制环中有三种功能:为进一步合成复制型起模板作用;继续起mRNA作用;构成感染性病毒RNA。
(2) 负链RNA病毒的复制 流感病毒、副流感病毒、狂犬病毒和腮腺炎病毒等有囊膜病毒属于这一范畴。病毒体中含有RNA的RNA聚合酶,从侵入链转录出mRNA,翻译出病毒结构蛋白和酶,同时又可做为模板,在依赖RNA的RNA聚合酶作用下合成子代负链RNA。
(3) 逆转录病毒(Retrovirus)复制过程 分二个阶段:第一阶段,病毒核时进入胞浆后,以RNA为模板,在依赖RNA的DNA多聚酶和tRNA引物的作用下,合成负链DNA(即RNA:DNA),正链RNA被降解,进而以负链DNA为模板形成双股DNA(即DNA:DNA),转入细胞核内,整合成宿主DNA中,成为前病毒。第二阶段,前病毒DNA转录出病毒mRNA,翻译出病毒蛋白质。同样从前病毒DNA转录出病毒RNA,在胞浆内装配,以出芽方式释放。被感染的细胞仍持续分裂将前病毒传递至子代细胞。
(五) 装配与释放:
DNA病毒 (多数核内装配);RNA病毒(多数胞浆内装配)
包膜病毒 (出芽释放);无包膜病毒(破胞释放)
新合成的病毒核酸和病毒结构蛋白在感染细胞内组合成病毒颗粒的过程称为装配(Assembly),而从细胞内转移到细胞外的过程为释放(Release)。大多数DNA病毒,在核内复制DNA,在胞浆内合成蛋白质,转入核内装配成熟。而痘苗病毒其全部成份及装配均在胞浆内完成。RNA病毒多在胞浆内复制核酸及合成蛋白。感染后6个小时,一个细胞可产生多达10,000个病毒颗粒。
病毒装配成熟后释放的方式有:(1)宿主细胞裂解,病毒释放到周围环境中,见于无囊膜病毒,如腺病毒、脊髓灰质炎病毒等;(2)以出芽的方式释放,见于有囊膜病毒,如疱疹病毒在核膜上获得囊膜,流感病毒在细胞膜上获得囊膜而成熟,然后以出芽方式释放出成熟病毒。也可通过细胞间桥或细胞融合邻近的细胞。
暂无品牌问答