实验方法原理 | |||||||||||
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实验材料 | DNA酵母株 试剂、试剂盒 | PCR引物聚乙二醇甘油存储液Tris·ClX-gal平板完全极限(CM)缺失成分培养基和平板 仪器、耗材 | 30℃和42℃培养箱或水浴 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1.使用标准的亚克隆技术,将编码诱饵蛋白的DNA插入PEG202的多克隆位点构建诱馆质粒(pBait)。 2.按照乙酸锂酵母转化法用pBait和pSH18-34(lacZ报道载体)转化相互作用阱筛选酵母株(EGY48)。 3.将转化株涂布到Glu/CM-His、-Ura平板上,放置于30℃培养箱中。 4.进行lacZacZ激活和亮氨酸需求平板检测以确保诱饵蛋白不会自己激活报道基因。 5.用阻遏测试法确定诱饵蛋白的合成。 6.将转化的EGY48(步骤3)接种到20mlGlu/CM-His、-Ura液体培养基,于30℃振荡过夜。 7.测量OD600吸光值,在250mlGlu/CM-His、-Ura培养基中稀释至5×106细胞/ml。0.1的OD600相当于大约3×106细胞/ml。这个数值应当在每个应用的酵母株得到确认。 8.于30℃振荡培养细胞至OD600为0.6~0.8(约5~6h)。 9.将培养液分为5个50ml圆锥形离心管中,室温下于3000g离心5min。 10.弃上清,将酵母沉淀重悬于25ml无菌水中,重复离心。 11.弃上清,将酵母沉淀重悬于1ml100mmol/L乙酸锂中。移到一1.5ml微量离心管中,室温下20800g离心15s沉淀酵母。 12.吸去上清,重悬酵母于350ul100mmol/L乙酸锂中(终体积约500ul)。 13.将每个管中的溶液分为10个50ul,室温下20800g离心15s沉下酵母。 14.吸去上清,依次加入下列成分: 240ul50%(m/V)PEG3350 36ul1mol/L乙酸锂 50ul2mg/ml单链载体DNA(100ug) 25ul40ug/ml肽适配体库DNA(1ug)。 在使用前,单链载体DNA需要加热到95℃放置5min,然后放冰上冷却。 15.剧烈振荡转化混合物直至酵母沉淀完全重悬起来,然后于30℃孵育30min。 16.于42℃热激20min。 17.室温下20800g离心15s沉下酵母。 18.吸去上清,重悬酵母于500ul无菌水中。 19.将48个转化株分别涂布到单独的15cmGlu/CM-His、-Ura、-Trp平板上。 20.两个剩下的转化株各取400ul涂布到15cmGlu/CM-His、-Ura、-Trp平板上。 21.用剩下的100ul测定转化效率。用水进行一系列10倍的稀释,然后涂布到10cmGlu/CM-His、-Ura、-Trp平板上。 22.于30℃孵育2~3天(直至克隆的直径约为1mm)。 23.将50个转化平板上的酵母(步骤19、20)收集到的一个50ml的离心管中。 24.加入等体积的2×甘油存储液到收集的酵母细胞中。分装为1ml的小份并存储于-70℃。 25.检测冻存的小份酵母的平板效率。 26.接种肽适配体库的10个库等价物到2mlGal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp液体培养基中。于30℃振荡培养4h。一个库等价物等于含有肽适配体库的酵母转化株的总数,如步骤21所检测的。 27.室温下于3000g离心4min。 28.吸去上清,重悬酵母于1ml无菌水中。 29.将酵母以106个酵母细胞/平板的密度涂布到15cmGal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、-Leu的平板上。 30.于30℃培养,每天观测平板生长情况。 31.将克隆划线接种到10cmGlu/CM-His、-Ura、-Trp的主平板上。于30℃培养1~2天。 32.将主平板在下列指示平板上复制: 34.提取所需的肽适配体表达质粒。 35.以质粒为模板,对肽适配体的可变区进行测序。 36.为了从pBait和pSH18-34中分离出适配体质粒,转化E.coli并用扩增硫氧还蛋白的引物通过PCR鉴定出正确的转化株。 1.材料 编码所感兴趣的诱饵蛋白的DNA 质粒DNA:PEG202,PSH18-34 酵母株:EGY48ura3trp1his33LescA-operator-Leu2 2.试剂 2mg/ml单链载体DNA(钠盐Ⅲ型,源于鲑鱼睾丸,Sigma)溶于TE缓冲液 40ug/ml肽适配体库DNA(pJM-1适体质粒) 硫氧还蛋白的PCR引物 完全极限(CM)缺失成分培养基和平板,补加2%(m/V)葡萄糖(Glu)或2%(m/V)半乳糖和1%(m/V)棉籽糖(Gal/Raf): Glu/CM-His、-Ura(10cm板或液体培养基) Glu/CM-His、-Ura、-Trp(10cm和15cm板) Glu/CM-His、-Ura、-Trp、-Leu(10cm板) Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp(液体培养基) Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、-Leu(10和15cm板) 100mmol/L和1mol/L乙酸锂,pH7.5,过滤除菌 50%(m/V)聚乙二醇,mol.wt.3350(PEG3350;Sigma) 2×甘油存储液:65%(V/V)甘油/0.1mol/LMgSO4/25mmol/LTri·Cl,PH7.4 10cmX-gal平板: Glu/CM-His、-Ura、-Trp、X-gal Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、Xgal 3.耗材 30℃和42℃培养箱或水浴 |