时间分辩荧光分析法 1）铕荧光检测法 标记靶细胞 1．EuCl3的制备：称取58.08mgEu2O3，用少量1NHCl搅拌至溶解，再用1NNaOH调节pH至4.0。加双蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存备用。 2．用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×106/ml，加50μl10mg/ml硫酸葡聚糖，置冰浴中20分钟，其间摇晃数次。 3．加入30μl100mmol/LCaCl2溶液终止反应5分钟。 4．用含2mmol/LCaCl2的RPMI-1640培养液洗涤细胞5次。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×104/ml。 检测方法 1．在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞悬液，每孔加100μl。 2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl0.5％TritonX-100。每个实验置三个复孔。 3．置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养3小时。 4．从每孔吸出20μl上清液，对应加入另一块96孔酶标板中，向第二块板每孔加200μl增强液。室温中混合5分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做EuCl3的标准曲线：用0.05mol/LpH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度 5．特异性杀伤活性计算：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％ 2）用时间分辩荧光检测法同时检测NK细胞对三种靶细胞的细胞毒性 标记靶细胞 1．取107靶细胞，用洗涤液（含93mmol/LNaCl,5mmol/LKCl和2mmol/LMgCl2的50mmol/LpH7.4Hepes，双蒸水配制）洗涤一次。小心吸去上清液，用1ml标记液（洗涤液中加0.5mg/ml磷酸葡聚糖和0.06mmol/LEu3+或2mmol/LSm3+或0.2mol/LTb3+，以及比镧系离子浓度高5倍的DTPA）悬浮细胞。将细胞悬液置冰上20分钟，每3分钟上下吹打1次。 2．加入2ml终止液（洗涤液中加2mmol/LCaCl2和10mmol/L葡萄糖），终止标记反应并使细胞膜上的孔隙封闭。5分钟后用终止液洗涤3次，用细胞培养液洗涤3次，每次洗涤时离心500×g10分钟。 3．用细胞培养液将细胞配成1.2×105/ml或5×104/ml备用。 NK细胞毒试验 1．取96孔圆底细胞培养板，每孔加3中标记靶细胞悬液各0.033ml和0.1ml不同浓度的NK细胞，使效靶比从100：1到6：1。自发释放对照中不加效应细胞，只加0.1ml细胞培养液。最大释放对照中不加效应细胞，加0.1ml1％TritonX-100。每种处理重复3孔。 2．在37℃5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。 3．离心1500×g10分钟。每孔取20μl上清液对应转移到另一块96孔平底细胞培养板中。每孔加200μlDelfia增强液，用下表的条件测定Eu3+和Sm3＋的荧光强度。 循环时间（ms） 滞留时间（ms） 计数时间（ms） 发射波长（nm） Eu3＋ 1 0.4 0.4 613 Sm3＋ 1 0.05 0.1 643 Tb3＋ 2 0.5 1.4 545 4．用下式计算特异性杀伤活性：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％ 3）用荧光增强配体标记的靶细胞检测CMC活性 1．标记靶细胞：在1×106/mlK562细胞中加入BA-TDA到10μmol/L，37℃标记30分钟。用洗涤液（137mmol/LNaCl，4.2mmol/LNaHCO3，5mmol/LKCl，0.44mmol/LKH2PO4，1.2mmol/LTESpH7.4）洗涤细胞5次。用细胞培养液将细胞配成5×104/ml。 2．取96孔圆底细胞培养板，每孔加0.1ml标记靶细胞悬液和0.1ml不同浓度的NK细胞，使效靶比从100：1到6：1。自发释放对照中不加效应细胞，只加0.1ml细胞培养液；最大释放对照中不加效应细胞，加0.1ml1％TritonX-100。每种处理重复3孔。 3．在37℃5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。 4．离心1500×g10分钟。每孔取20μl上清液对应转移到另一块96孔平底细胞培养板中。第二块板每孔加180μlEu3＋溶液，摇晃5分钟后用时间分辩荧光分析仪检测荧光强度。计算杀伤活性。
