细胞介导细胞毒作用检测法2：[3H]脱氧胸苷释放法
[3H]脱氧胸苷释放法 1）标记靶细胞 1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成2×106/ml，取10μCi（370kBq）[3H]TdR加到1ml靶细胞中，37℃水浴标记4～6小时，每30分钟摇晃一次。 2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g10分钟。用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调整为1×105/ml备用。 2）[3H]TdR释放实验 1．在96孔圆底细胞培养板中加入标记的靶细胞，每孔加100μl（含1×104细胞）。 2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔不加效应细胞只加100μlRPMI-1640培养液。阳性对照孔中加100μl1％NP40。每个实验置三个复孔。 3．置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱培养18小时。 4．离心培养板200×g10分钟，从每孔中吸出150μl上清液。每孔加150μl含1mg/ml胰蛋白酶和10μg/mlDNA酶的Hanks液，在37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中继续培养30分钟。 5．稍振荡后离心沉淀细胞。每孔吸出100μl上清液置液闪瓶中。 6．每孔加100μl5％三氯醋酸，用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用5％三氯醋酸洗滤纸3次，将滤纸置液闪瓶中。 7．在液闪计数仪上分别测定上清液中细胞中的每分钟放射性活性（cpm值）。上清液cpm×2是死细胞释放的cpm；细胞cpm＋上清液cpm×2代表总cpm。 杀伤活性（％）＝[（上清液cpm×2）/（细胞cpm＋上清液cpm×2）]×100％
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发布于 ： 2021-09-16
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