不连续非变性凝肢电泳实验一不连续非变性凝肢电泳

1.工作溶液配制

2.工作溶液用量

（1）制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积

制备两块6cm×8cm的凝胶

配制量应比实际用量稍多些。

（2）X％分离胶的计算

3.制备分离胶

（1）按操作指南装配好灌胶用的模具；

（2）将A液、B液和水在小的三角瓶或试管中混合（由于丙烯酰胺具有神经毒性。应戴手套操作）；

（3）在温和搅拌下，加入过硫酸铵，TEME混匀。由于这一步中发生聚合，动作要迅速；

（4）将上述胶液用滴管移入凝胶模具；

（5）加完分离胶后，立即轻轻在其顶部覆盖1～5mm的水垣；

（6）静置30～60min，待凝胶聚合；当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将出现一个明显的界面，这时将凝胶稍微倾斜。判断凝胶是否聚合。

4.堆积胶的制备

（1）除去覆盖在分离胶上的水层；

（2）在小三角烧瓶或试管中，将A液，C液和蒸馏水混合；

（3）在温和搅拌下，加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀；

（4）吸取堆积胶溶液加到分离胶之上，直至溶液到达前玻璃板的顶部。

（5）将梳子小心的插入到两块板之间，直至梳子齿底部到达前玻璃板的顶部，在梳子齿端避免留下气泡。

（6）放置30min，堆积胶可聚合；

（7）待堆积胶聚合后，小心的取出梳子，不要使加样孔裂缝；

（8）将凝胶置入电泳槽中，并接好正负电极；

（9）将电泳缓冲液加入内外电泳槽中。确保凝胶的上部和底部都浸在缓冲液中。

5.样品制备

（1）加样孔的样品容量（Mini-Gel系统）

（2）将蛋白质样品和样品缓冲液（20ul+5ul）在Eppendorf管中混匀；

（3）用微量注射器将样品加入加样孔中；

（4）在加入不同的样品之前。用注射器抽吸少量的电泳缓冲液冲洗注射器，以避免样品间的相互污染。

6.电泳

（1）将电极插头与适当的电极相接，对于体育pH8.8的凝胶，电流应流向阳极；

（2）将电压调至100～200V；

（3）电泳值示踪染料的前沿迁移到距凝胶底部约1～5mm处；

（4）关闭电源；

（5）拔掉电极插头；

（6）取出电泳凝胶板，放在一个安全的地方，轻轻撬开凝胶两边的玻璃板，使胶粘在其中的一块板上。

7.凝胶染色

（1）戴手套，将凝胶转移到一个含有约20ml考马斯亮蓝的培养皿内；

（2）在摇床上缓慢震荡，0.75mm的胶需要5～lOmin。1.5mm的凝胶需要10～20min，；

（3）去除染液；

（4）加入约50ml脱色液，继续轻微震荡；

（5）为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜；可进行干胶保存。