| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 蛋白质溶液 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺双丙烯酰胺Tris碱盐酸过硫酸铵TEMED甘氨酸甘油溴酚蓝甲醇冰醋酸 仪器、耗材 | Bio-RadMin-ProteanII凝胶电泳槽微量注射器或微量加样器染色和脱色用的小容器 实验步骤 | 1.工作溶液配制
2.工作溶液用量 （1）制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积 制备两块6cm×8cm的凝胶
配制量应比实际用量稍多些。 （2）X％分离胶的计算
3.制备分离胶 （1）按操作指南装配好灌胶用的模具；
（2）将A液、B液和水在小的三角瓶或试管中混合（由于丙烯酰胺具有神经毒性。应戴手套操作）； （3）在温和搅拌下，加入过硫酸铵，TEME混匀。由于这一步中发生聚合，动作要迅速； （4）将上述胶液用滴管移入凝胶模具； （5）加完分离胶后，立即轻轻在其顶部覆盖1～5mm的水垣； （6）静置30～60min，待凝胶聚合；当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将出现一个明显的界面，这时将凝胶稍微倾斜。判断凝胶是否聚合。 4.堆积胶的制备 （1）除去覆盖在分离胶上的水层； （2）在小三角烧瓶或试管中，将A液，C液和蒸馏水混合； （3）在温和搅拌下，加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀； （4）吸取堆积胶溶液加到分离胶之上，直至溶液到达前玻璃板的顶部。 （5）将梳子小心的插入到两块板之间，直至梳子齿底部到达前玻璃板的顶部，在梳子齿端避免留下气泡。 （6）放置30min，堆积胶可聚合； （7）待堆积胶聚合后，小心的取出梳子，不要使加样孔裂缝； （8）将凝胶置入电泳槽中，并接好正负电极； （9）将电泳缓冲液加入内外电泳槽中。确保凝胶的上部和底部都浸在缓冲液中。 5.样品制备 （1）加样孔的样品容量（Mini-Gel系统） （2）将蛋白质样品和样品缓冲液（20ul+5ul）在Eppendorf管中混匀； （3）用微量注射器将样品加入加样孔中； （4）在加入不同的样品之前。用注射器抽吸少量的电泳缓冲液冲洗注射器，以避免样品间的相互污染。 6.电泳 （1）将电极插头与适当的电极相接，对于体育pH8.8的凝胶，电流应流向阳极； （2）将电压调至100～200V； （3）电泳值示踪染料的前沿迁移到距凝胶底部约1～5mm处； （4）关闭电源； （5）拔掉电极插头； （6）取出电泳凝胶板，放在一个安全的地方，轻轻撬开凝胶两边的玻璃板，使胶粘在其中的一块板上。 7.凝胶染色 （1）戴手套，将凝胶转移到一个含有约20ml考马斯亮蓝的培养皿内； （2）在摇床上缓慢震荡，0.75mm的胶需要5～lOmin。1.5mm的凝胶需要10～20min，； （3）去除染液； （4）加入约50ml脱色液，继续轻微震荡； （5）为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜；可进行干胶保存。 注意事项 | 展开 其他 | 展开 |
