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发布于 : 2018-08-10 阅读(80)
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实验方法原理

非变性凝胶电泳通常是在高pH(8.8)缓冲液条件下进行。这时,多数蛋白质带负电荷,并向阳极迁移。

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

1.工作溶液配制



2.工作溶液用量

(1)制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积

制备两块6cm×8cm的凝胶

配制量应比实际用量稍多些。


(2)X%分离胶的计算


3.制备分离胶


(1)按操作指南装配好灌胶用的模具;


(2)将A液、B液和水在小的三角瓶或试管中混合(由于丙烯酰胺具有神经毒性。应戴手套操作);


(3)在温和搅拌下,加入过硫酸铵,TEME混匀。由于这一步中发生聚合,动作要迅速;


(4)将上述胶液用滴管移入凝胶模具;


(5)加完分离胶后,立即轻轻在其顶部覆盖1~5mm的水垣;


(6)静置30~60min,待凝胶聚合;当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将出现一个明显的界面,这时将凝胶稍微倾斜。判断凝胶是否聚合。


4.堆积胶的制备


(1)除去覆盖在分离胶上的水层;


(2)在小三角烧瓶或试管中,将A液,C液和蒸馏水混合;


(3)在温和搅拌下,加入过硫酸铵和TEMED,混合均匀;


(4)吸取堆积胶溶液加到分离胶之上,直至溶液到达前玻璃板的顶部。


(5)将梳子小心的插入到两块板之间,直至梳子齿底部到达前玻璃板的顶部,在梳子齿端避免留下气泡。


(6)放置30min,堆积胶可聚合;


(7)待堆积胶聚合后,小心的取出梳子,不要使加样孔裂缝;


(8)将凝胶置入电泳槽中,并接好正负电极;


(9)将电泳缓冲液加入内外电泳槽中。确保凝胶的上部和底部都浸在缓冲液中。


5.样品制备


(1)加样孔的样品容量(Mini-Gel系统)


(2)将蛋白质样品和样品缓冲液(20ul+5ul)在Eppendorf管中混匀;


(3)用微量注射器将样品加入加样孔中;


(4)在加入不同的样品之前。用注射器抽吸少量的电泳缓冲液冲洗注射器,以避免样品间的相互污染。


6.电泳


(1)将电极插头与适当的电极相接,对于体育pH8.8的凝胶,电流应流向阳极;


(2)将电压调至100~200V;


(3)电泳值示踪染料的前沿迁移到距凝胶底部约1~5mm处;


(4)关闭电源


(5)拔掉电极插头;


(6)取出电泳凝胶板,放在一个安全的地方,轻轻撬开凝胶两边的玻璃板,使胶粘在其中的一块板上。


7.凝胶染色


(1)戴手套,将凝胶转移到一个含有约20ml考马斯亮蓝的培养皿内;


(2)在摇床上缓慢震荡,0.75mm的胶需要5~lOmin。1.5mm的凝胶需要10~20min,;


(3)去除染液;


(4)加入约50ml脱色液,继续轻微震荡;


(5)为了脱色完全,需数次更换脱色液并震荡过夜;可进行干胶保存。

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注意事项
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其他
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