*请输入10-500个字符
已帮助
0人
0人
scfsl
用户
老师请教你几个问题：1.菌体上清过Q柱，收集穿过（未超过载量），分段洗脱（10%-45%含有目的蛋白），将含有目的蛋白段上苯基柱，收集洗脱，在上清、穿过、分段洗脱（10%-45%）、洗脱在同一浓度做ELISA检测，结果显示穿过的值较后两个都高，是什么原因，为什么Q会挂得不好。2.最近在做一蛋白，20mM磷酸盐缓冲液，PH7.4，过Q柱，线性洗脱显示，前50%含有目的蛋白，在上苯基柱（20mM PB+0.5M NaCl/20mM PB，PH7.4），穿过无目的蛋白，用20mM PB洗脱时能洗下很少一点，用水洗脱时目的蛋白基本洗下，但是都很不纯（我目的蛋白20KD,在40KD处有个很明显的条带），请问老师这种应该怎么做，（凝胶柱G75分不开），怎么进行后续试验，谢谢了！
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用cszopen版主你好：我最近一直在做纯化，但结果一直不好，请你帮忙分析一下。我用的表达载体是pET32a，转化BL21(DE3)进行表达。蛋白等电点8.938，是一个细菌的外膜蛋白。包涵体纯化：变性结合缓冲液、漂洗缓冲液、洗脱缓冲液pH值分别为：8.0、6.3、5.9.。（这是按柱子的说明书做的）用的是Ni-NTA柱。本来想纯化复性一起做，但蛋白挂不上柱，基本都在穿过峰中流下来了。后来才先做纯化。但纯化的结果是，目的条带在穿过峰中很少（应该说明挂柱情况还可以吧？），大部分蛋白在漂洗缓冲液中就洗下来了，而洗脱缓冲液中的量很少（感觉这很不正常，不知为何？应该在洗脱液中量多一些才对吧？）。（附图2张）前面一张Marker左边有条带的部分为漂洗液中漂洗下来的目的蛋白，再前面是穿过峰。后面一张最左边的几条带为洗脱缓冲液洗脱下来的目的带，但量却很少。不知道为什么会出现这种情况？还有一个问题，蛋白的等电点对蛋白的纯化有没有影响，多大影响？缓冲液的pH值跟它应该没有关系吧？那在透析复性是透析液的pH值是否受等电点的影响？看资料说，透析时透析液的pH值一般在8.0-9.0之间比较合适。那就跟我的蛋白等电点很近了，不知有没有影响？辛苦版主解答一下，初次做纯化，说的可能比较啰嗦。:)......那说明书是有点误导，其实说明书只参考，但是大多人把它当金科玉律，对大多包涵体，用降低pH是洗不下蛋白的,即使少数可以也可能杂蛋白洗不干净,你可选择用不同浓度的咪唑洗试试.何况从你第一张电泳图看,穿透的很干净,那你就收集穿透的不就得了,纯化不一定洗脱的才是你要的:)通常缓冲液都不应该和等电点太近,否则容易沉淀.纯化通常要灵活,书或别人的经验只是参考.
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用scfsl老师请教你几个问题：1.菌体上清过Q柱，收集穿过（未超过载量），分段洗脱（10%-45%含有目的蛋白），将含有目的蛋白段上苯基柱，收集洗脱，在上清、穿过、分段洗脱（10%-45%）、洗脱在同一浓度做ELISA检测，结果显示穿过的值较后两个都高，是什么原因，为什么Q会挂得不好。2.最近在做一蛋白，20mM磷酸盐缓冲液，PH7.4，过Q柱，线性洗脱显示，前50%含有目的蛋白，在上苯基柱（20mMPB+0.5MNaCl/20mMPB，PH7.4），穿过无目的蛋白，用20mMPB洗脱时能洗下很少一点，用水洗脱时目的蛋白基本洗下，但是都很不纯（我目的蛋白20KD,在40KD处有个很明显的条带），请问老师这种应该怎么做，（凝胶柱G75分不开），怎么进行后续试验，谢谢了！......挂不好也许和缓冲液及pH有关.不纯很正常,也许吸附比较牢,你可选择丁基或别的方法.
已帮助
0人
0人
quguoli83
用户请教您一个问题：我提的动物组织蛋白，再利用TCA-丙酮除盐后的沉淀蛋白不能溶解，这是为什么？（TCA沉淀的蛋白利用丙酮反复洗两到三遍仍不能溶解）
已帮助
0人
0人
caron_zk
用户请教您一个问题：我除热原使用阴离子填料QSepharoseFF，缓冲体系20mMPB,pH6.0,为何过柱之后pH值会变化，降至4.0，就算预平衡10个柱体积，pH值依然是4.0左右。是否说名磷酸盐缓冲液不适用于离子交换填料，那么pH6-7之间还有什么合适的缓冲体系可以选择？多谢楼主啦
已帮助
0人
0人
chromatography
用户quguoli83请教您一个问题：我提的动物组织蛋白，再利用TCA-丙酮除盐后的沉淀蛋白不能溶解，这是为什么？（TCA沉淀的蛋白利用丙酮反复洗两到三遍仍不能溶解）TCA-丙酮沉淀蛋白的变性是不可逆的,通常难溶解,除非是变性条件下,如加电泳缓冲液煮,而普通缓冲液不能溶解很正常.
已帮助
0人
0人
chromatography
用户caron_zk请教您一个问题：我除热原使用阴离子填料QSepharoseFF，缓冲体系20mMPB,pH6.0,为何过柱之后pH值会变化，降至4.0，就算预平衡10个柱体积，pH值依然是4.0左右。是否说名磷酸盐缓冲液不适用于离子交换填料，那么pH6-7之间还有什么合适的缓冲体系可以选择？多谢楼主啦通常阳柱选择磷酸盐缓冲液,而阴柱选择tris-Hcl缓冲液,不过我觉得应该是你没平衡到,多平衡时间看看,
已帮助
0人
0人
zzzzz2001
用户楼主你好，请问一个离子交换层析的问题，我使用的是GE的QSFF填料，XK-16,XK-26都使用过，目前采用此柱进行内毒素的去除，之前此柱也有过类似操作，使用1NNaOH处理层析柱1h，问题如下：上样蛋白分子量约为200KDa，有不确定含量的糖基化，通过预装柱及XK-16条件摸索，确定pH7-8的范围，5ms/cm，可以与填料较好结合，进行分离，预实验时上样量约为20mg，正式实验时，CV=65ml，上样量超过200mg，突然出现流穿，且流穿蛋白浓度上升很快，可接近上样浓度，请问有什么可能的原因么？为排除填料载量问题，使用过其他较新层析柱，出现同样问题，且在上样过程中检测到pH值会下降0.3左右，再平衡后才恢复正常。
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用zzzzz2001楼主你好，请问一个离子交换层析的问题，我使用的是GE的QSFF填料，XK-16,XK-26都使用过，目前采用此柱进行内毒素的去除，之前此柱也有过类似操作，使用1NNaOH处理层析柱1h，问题如下：上样蛋白分子量约为200KDa，有不确定含量的糖基化，通过预装柱及XK-16条件摸索，确定pH7-8的范围，5ms/cm，可以与填料较好结合，进行分离，预实验时上样量约为20mg，正式实验时，CV=65ml，上样量超过200mg，突然出现流穿，且流穿蛋白浓度上升很快，可接近上样浓度，请问有什么可能的原因么？为排除填料载量问题，使用过其他较新层析柱，出现同样问题，且在上样过程中检测到pH值会下降0.3左右，再平衡后才恢复正常。......很难说是什么原因,我觉得也许你样品的缓冲液和平衡柱子的不一致或样品有盐或缓冲液浓度过高,你可就这几方面改变看看,此外可稍微提高结合的pH也许会好点,流穿到开始的浓度那说明填料已经饱和了,此外你可稍微降低流速看看,总之自己做些改变,找到相应的原因和解决方法.
已帮助
0人
0人
rudy668
用户楼主，最近我要进行Purifier的校正，但是说明书丢了电导率仪校正不好求标准方法谢谢
已帮助
0人
0人
chromatography
用户rudy668楼主，最近我要进行Purifier的校正，但是说明书丢了电导率仪校正不好求标准方法谢谢抱歉,这个你最好问厂家.或发外面问问.
已帮助
0人
0人
rudy668
用户chromatography抱歉,这个你最好问厂家.或发外面问问.哦知道了谢谢
已帮助
0人
0人
guming_21
用户您好，我提取乳腺组织的蛋白，但是提完啦总是发黄，像泥浆的颜色，上清还有絮状物，离心也不行。。。。做WB时候蛋白弥散的厉害，整个泳道都显色，不能分带。希望您帮助分析原因，最好提蛋白，WB都分析下，谢谢啦！PS：我的蛋白提取方法，组织+裂解液+PMSF用剪刀剪碎，超生匀浆，4C，10000转，5分钟离心取上清，-70保存。
已帮助
0人
0人
潘思拉佳
用户版主好有个很着急的问题，我分离蛋白，我的目标蛋白都是在2w以下的，但是我的样品里是很杂的，请问我有什么方法才能经济的把2w以下的从样品里给分开呢？
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用guming_21您好，我提取乳腺组织的蛋白，但是提完啦总是发黄，像泥浆的颜色，上清还有絮状物，离心也不行。。。。做WB时候蛋白弥散的厉害，整个泳道都显色，不能分带。希望您帮助分析原因，最好提蛋白，WB都分析下，谢谢啦！PS：我的蛋白提取方法，组织+裂解液+PMSF用剪刀剪碎，超生匀浆，4C，10000转，5分钟离心取上清，-70保存。......我对提取也不特别熟悉,我觉得如果你样品不澄清那跑电泳就不好跑,你可离心速度快点或过滤试试,还可用有机溶剂沉淀等试试吧.
已帮助
0人
0人
chromatography
用户潘思拉佳版主好有个很着急的问题，我分离蛋白，我的目标蛋白都是在2w以下的，但是我的样品里是很杂的，请问我有什么方法才能经济的把2w以下的从样品里给分开呢？可先选择G50理论上可把3万以上去掉,再配合别的分离手段,我觉得最好是参考文献
已帮助
0人
0人
guming_21
用户chromatography我对提取也不特别熟悉,我觉得如果你样品不澄清那跑电泳就不好跑,你可离心速度快点或过滤试试,还可用有机溶剂沉淀等试试吧.过滤您告诉下，怎么做吗？谢谢啦
已帮助
0人
0人
zzzzz2001
用户chromatography很难说是什么原因,我觉得也许你样品的缓冲液和平衡柱子的不一致或样品有盐或缓冲液浓度过高,你可就这几方面改变看看,此外可稍微提高结合的pH也许会好点,流穿到开始的浓度那说明填料已经饱和了,此外你可稍微降低流速看看,总之自己做些改变,找到相应的原因和解决方法.上次的问题：zzzzz2001wrote:楼主你好，请问一个离子交换层析的问题，我使用的是GE的QSFF填料，XK-16,XK-26都使用过，目前采用此柱进行内毒素的去除，之前此柱也有过类似操作，使用1NNaOH处理层析柱1h，问题如下：上样蛋白分子量约为200KDa，有不确定含量的糖基化，通过预装柱及XK-16条件摸索，确定pH7-8的范围，5ms/cm，可以与填料较好结合，进行分离，预实验时上样量约为20mg，正式实验时，CV=65ml，上样量超过200mg，突然出现流穿，且流穿蛋白浓度上升很快，可接近上样浓度，请问有什么可能的原因么？为排除填料载量问题，使用过其他较新层析柱，出现同样问题，且在上样过程中检测到pH值会下降0.3左右，再平衡后才恢复正常。此次的问题：您好，楼主，目前经过几次摸索，使用AKTA在线监控，已可以确定样品BUFFER与平衡液一致，缓冲液浓度也应是正常的，调高pH之后，结合力似乎有所增强，但不确定，流穿仍然在某一点突然上升，流速调低对情况没有改变，如果如您所说载量饱和，请问离子柱的离子载量与蛋白载量的换算是如何算法呢？以及如何通过其离子载量推测某蛋白载量？谢谢！
已帮助
0人
0人
guming_21
用户guming_21过滤您告诉下，怎么做吗？谢谢啦对滤网大小有要求吗？还有其他操作吗？
已帮助
0人
0人
aeolian1985
用户我想问下Novagen的Ni柱，手册上说用的的His•BindBufferKit要求为0.5MNaCl,20mMTirs-HCl,体系pH7.9bingdingbuffer咪唑浓度为5mMwashbuffer咪唑浓度为60mMElutebuffer咪唑浓度为1M我根据自己蛋白实际，改用buffer体系为2MNaCl，20mMNa2HPO4，pH7.0，各溶液咪唑浓度不变，不知是否可以呢？
已帮助
0人
0人
wht5945
用户你好，我是个新手，这里想请教一下关于Nisepharose6ff的使用问题，我不想过柱子，直接亲和纯化的话需要怎么做呢，不知道这种方法可行不是不是和纯化GST的glutathionesepharose4b的使用类似？需要配制哪些buffer？要是有一份详细的资料就好了，都还希望老兄多多指点！！谢谢！！！
已帮助
0人
0人
yanj13
用户楼主你好！最近我要做个PPT关于蛋白质纯化和保存的，能不能给我推荐一些资料！？谢谢先！
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用aeolian1985我想问下Novagen的Ni柱，手册上说用的的His•BindBufferKit要求为0.5MNaCl,20mMTirs-HCl,体系pH7.9bingdingbuffer咪唑浓度为5mMwashbuffer咪唑浓度为60mMElutebuffer咪唑浓度为1M我根据自己蛋白实际，改用buffer体系为2MNaCl，20mMNa2HPO4，pH7.0，各溶液咪唑浓度不变，不知是否可以呢？......也可以，但是ｐＨ高点可结合更好点.
已帮助
0人
0人
chromatography
用户yanj13楼主你好！最近我要做个PPT关于蛋白质纯化和保存的，能不能给我推荐一些资料！？谢谢先！抱歉,最好查文献,我也没材料.
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用wht5945你好，我是个新手，这里想请教一下关于Nisepharose6ff的使用问题，我不想过柱子，直接亲和纯化的话需要怎么做呢，不知道这种方法可行不是不是和纯化GST的glutathionesepharose4b的使用类似？需要配制哪些buffer？要是有一份详细的资料就好了，都还希望老兄多多指点！！谢谢！！！......已经短信回复,可差不多和glutathionesepharose4b的使用类似,缓冲液可按镍柱的即可,只是如果蛋白浓度太低,不适合这个方法.因为结合力低.
已帮助
0人
0人
孤帆2008_2008
用户唉昨天因为填料的事郁闷了一晚今天终于找到地方了太好了:)
已帮助
0人
0人
从月
用户看了版主这么多帖子，尤为敬佩啊！想请版主指点一下我这位新手，多谢多谢！:)我做的是从细胞中纯化GST，然后进一步用HPLC进行GST亚型分选（主要是想得到GSTM1），现在问题卡在纯化柱填料我不知道买什么样的？打算欲购GSH-SefinoseTM,但是看说明好像主要用途是用于GST融合蛋白的，不知道它能不能结合上GST所有亚型。希望版主多多帮忙，不胜感激！
已帮助
0人
0人
ecust小熊
用户请问lz，我们采用PVDF膜湿转，以前采用的是300mA，每kb2min进行的。结果一般都可以。现在电泳仪换了，只能达到200mA，电压只能达到150V。我们隔壁实验室采用的也是湿转，采用100V，1小时。不考虑分子量大小的问题。或者他们采用20mA过夜处理，结果都不错。现在我有一个比较困惑的问题：蛋白与膜结合之后，如果继续转的话，蛋白质会不会穿膜啊？有人说电流大，转膜时间长的话，就会发生穿膜现象。我觉着以前我们采用300mA，每kb2min，遇到60kb左右的都要转2h，而有的抗体并不是单抗，在小分量和大分子量的区域都出现过非特异条带，如果前面网友说的是正确的话，为何小分子量的蛋白还存留在膜上？我一直觉着蛋白和膜一旦结合上去的话，应该没有那么容易脱离的吧？谢谢。。。
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用从月看了版主这么多帖子，尤为敬佩啊！想请版主指点一下我这位新手，多谢多谢！:)我做的是从细胞中纯化GST，然后进一步用HPLC进行GST亚型分选（主要是想得到GSTM1），现在问题卡在纯化柱填料我不知道买什么样的？打算欲购GSH-SefinoseTM,但是看说明好像主要用途是用于GST融合蛋白的，不知道它能不能结合上GST所有亚型。希望版主多多帮忙，不胜感激！......理论上能用于GST融合蛋白纯化的都应该可用于GST的纯化,只要它们底物都是GSH就没问题.
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用ecust小熊请问lz，我们采用PVDF膜湿转，以前采用的是300mA，每kb2min进行的。结果一般都可以。现在电泳仪换了，只能达到200mA，电压只能达到150V。我们隔壁实验室采用的也是湿转，采用100V，1小时。不考虑分子量大小的问题。或者他们采用20mA过夜处理，结果都不错。现在我有一个比较困惑的问题：蛋白与膜结合之后，如果继续转的话，蛋白质会不会穿膜啊？有人说电流大，转膜时间长的话，就会发生穿膜现象。我觉着以前我们采用300mA，每kb2min，遇到60kb左右的都要转2h，而有的抗体并不是单抗，在小分量和大分子量的区域都出现过非特异条带，如果前面网友说的是正确的话，为何小分子量的蛋白还存留在膜上？我一直觉着蛋白和膜一旦结合上去的话，应该没有那么容易脱离的吧？谢谢。。。......抱歉,我对这个问题不大熟悉,你可发外面问问.
已帮助
0人
0人
lvqin123
用户chromatography，你好。我是新手，未纯化过蛋白，最近因需要才开始阅读相关资料，但扔是一头雾水。我欲纯化的是一个细胞外表达蛋白，分子量有300KD的大蛋白，PI值5.2。查阅的文献纯化该蛋白的方法是;0.5-1升转染的上清加到DEAEsepharose柱子上，用的50mMTris/HCl,pH8.6,containing0.2MNaCl液平衡柱子。再用线性梯度0.2to0.8MNaCl洗脱，得到0.4，0.55MNaCl的两个所需蛋白峰。获得蛋白0.2M重碳酸铵透析，再超滤浓缩。我想了解，我该买多大的层析柱？就是多少上清需要用多大的柱子呢？我是否可以直接用0.4，0.55MNaCl这两个阶段洗脱，获得自己要的目的蛋白？该技术是否有存在的疑问和需要注意的呢？请指教！！
已帮助
0人
0人
chromatography
用户展开引用lvqin123chromatography，你好。我是新手，未纯化过蛋白，最近因需要才开始阅读相关资料，但扔是一头雾水。我欲纯化的是一个细胞外表达蛋白，分子量有300KD的大蛋白，PI值5.2。查阅的文献纯化该蛋白的方法是;0.5-1升转染的上清加到DEAEsepharose柱子上，用的50mMTris/HCl,pH8.6,containing0.2MNaCl液平衡柱子。再用线性梯度0.2to0.8MNaCl洗脱，得到0.4，0.55MNaCl的两个所需蛋白峰。获得蛋白0.2M重碳酸铵透析，再超滤浓缩。我想了解，我该买多大的层析柱？就是多少上清需要用多大的柱子呢？我是否可以直接用0.4，0.55MNaCl这两个阶段洗脱，获得自己要的目的蛋白？该技术是否有存在的疑问和需要注意的呢？请指教！！......文献上应该有柱子的大小规格的,你应该留意看看,理论上可用0.4，0.55MNaCl这两个阶段洗脱,他也应该是从线性洗脱曲线估算的,你只能试试,柱子大小还可根据你表达量和体积算,一般按10-20mg/ml填料可估算出需要填料体积,有填料体积可选择柱,通常短粗柱即可.注意事项是常识问题,需要自己去看看有关离子交换色谱的书,我怕说不清楚也不系统.
已帮助
0人
0人
catherine56
用户楼主您好！急求帮助！！！我想用G25对血浆样品脱盐，然后用生物质谱测血浆中与汞结合的蛋白或其他化合物。由于血浆非常少，过柱不现实，现在问到的一个方法是将血浆加到活化好的G25上，G25就加在小EP管里，作用一段时间后，离心取上清即为“脱盐”后的样品。请问这个方法可行吗？如果可行，一般上样量是怎么的？再问一个弱弱的问题：处理尿所用的固相萃取小柱是不是主要用来除蛋白的？蛋白吸附于柱上之后能否用有机溶剂洗脱（蛋白变性没关系）感激不尽！！！
已帮助
0人
0人
aeolian1985
用户chromatography也可以，但是ｐＨ高点可结合更好点.谢谢楼主啊，真是高手+热心人，不过像我的蛋白这种需要在高盐条件（2MNaCl，20mMNa2HPO4）下纯化的，过Novagen的小柱子除咪唑一般都使用透析的方法，如果用AKTA的蛋白纯化系统过HisTrap_FF_crude_5_ml柱子纯化蛋白，高盐缓冲液造成蛋白峰会被覆盖，是否应该放大量表达，一次大概需要摇多少LB培养基？（我尝试过一次，摇了200ml培养基，当咪唑梯度到500mM时，只看见貌似有个很宽很小的峰包但不确定是否蛋白的峰），浓度太低跑胶也没跑出来。没用过超滤管，一直担心使用超滤管对于我这种高盐buffer是不是很容易让蛋白析出啊？
▍
相关分类
▍
相关文章
▍
相关问答
