基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂实验一基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂
实验材料 | PRSETB细菌表达质粒HeLa细胞株 试剂、试剂盒 | 苯甲基横酰基氟化物EGTA缓冲液氯化钙缓冲液 仪器、耗材 | 超声发生器荧光光谱仪 实验步骤 | 本文中描述的方法涵盖了变色子在细菌及真核细胞里的克隆与表达(见4.3.1),变色子的生物化学和生物物理特征鉴定(见4.3.2),以及通过FRET技术将变色子用于体内Ca2+成像(见4.3.3)。 3.1变色子的克隆 使用5个不同的部件:CFP、YFP、N-CaM、C-CaM和CRS,用标准的重组DNA方法[8]模块式组装钙变色子。CFP和YFP质粒可从Clontech购得;CaM来自Dr.Ikum;CRS用寡核苷酸链反应合成。为制取钙变色子的DNA操控不在这里详细讲述,因为没有适合所有可能性的单一技术(见注4)。钙变色子制成之后,融合片段克隆到PRSETB质粒中,以表达足够蛋白,完成生物化学和生物物理鉴定。我们把融合片段克隆到pCDNA3质粒中(见注5),以供体内Ca2+成像实验用的瞬时哺乳细胞表达。 3.2生物化学和生物物理鉴定 钙变色子在能够用于体内Ca2+成像之前,先提纯(见4.3.2.1和注6)并完成体内荧光实验,以确定其动态范围(见4.3.2.2)和钙离子结合曲线(见4.3.2.3)。 3.2.1钙变色子从细菌细胞中提纯 (1)用标准的分子生物学方法以细菌质粒转染BL21(DE3)细胞[8]。 (2)把细胞平铺在含氨苄青霉素的LB平板上,37°C保温过夜。 (3)选择一单菌落,37°C,在100ml含100μmol/L氨苄青霉素的LB培养液中生长。 (4)在600nm光学密度为0.7时,用0.5mmol/LIPTG诱导3h。 (5)以3000g离心细胞30min。 (6)重悬细胞于10ml,pH7.4,含10%甘油、100mmol氯化钾、1mmol/L氯化钙和1mmol/L苯基甲基磺酰基氟化物的50mmol/LHEPES中。 (7)用0.5英寸超声头以最大功率,10%工作周期,超声4次,每次4min。两次超声之间,溶液降温5min。 (8)以30000g离心细胞碎片20min。 (9)在4°C轻轻地混合上清液与1mlNi-NTA琼脂糖浆液30min。 (10)以10ml含100mmol/L氯化钾和5mmol/L咪唑pH7.4的50mmol/LHEPES洗柱。 (11)用1ml含100mmol/L氯化钾和100mmol/L咪唑的50mmol/LHEPES洗脱。不需要切掉His-tag,因为它并不干扰荧光特性。 (12)在4°C,用2L含100mmol/L氯化钾,pH7.4的50mmol/LHEPES透析样品。 3.2.2荧光谱分析 FRET效率的变化(或者,在钙变色子的情形下,Ca2+浓度的变化)常常可以从发射比的变化观察到(只为受体发射的峰值强度除以给体的峰值发射强度)。Ca2+指示子的动态范围定义为最大比率Rmax除以最小比率Rmin。较大的动态范围在体内Ca2+指示上更有效。 (1)在装有含100mmol/L氯化钾,20μmol/LEGTA的50mmol/LHEPES的1ml试管中稀释样品。只要发射信号保持可测,任何稀释因子都可用。在433nm激发下,记录从450~570nm的荧光发射谱。 (2)记录空白样品的荧光发射谱。 (3)从第(1)步的记录中减去第(2)步的记录,以得到在无Ca2+条件下钙变色子的荧光谱。从这个谱中确定Rmin。 (4)在1mmol/LCa2+存在的条件下,重复(1)~(3)步,以确定Ca2+存在时钙变色子的荧光谱。 (5)图4.3显示YC6.1[5]在加入Ca2+之前和之后的荧光谱,及Rmax和Rmin分别为1.1和2.4。 3.2.3Ca2+结合性质 Ca2+结合曲线用来评估Ca2+指示器能够测量的[Ca2+]的有效范围。Ca2+/EDTA和Ca2+/EGTA缓冲液用来作为浓度标准,因为在低[Ca2+],Ca2+污染会显著地扭曲空白[Ca2+]水平(见注7)。 (1)在1ml试管中,用EGTA稀释样品。在433nm激发下,记录从450~570nm的荧光发射谱。确定激发比。 (2)为得到Ca2+结合曲线,连续地加入氯化钙溶液到样品中,并测定发射比。因为本章描述的实验是在20°C的EGTA和氯化钙缓冲液中完成的,通过解下述二次方程(如在不同条件下,请参考文献[9])可求得自由钙: (3)为绘出Ca2+结合曲线,将[Ca2+]对发射比作图。图4.4显示YC6.1的Ca2+结合曲线。 3.3用钙变色子使Ca2+成像 本节描述简单的HeLa细胞中Ca2+成像实验;但是只需很小的修正,此方法可应用于其他的黏着细胞和生理条件。分别描述细胞培养液制备(见4.3.3.1)和数据采集(见4.3.3.2)。 3.3.1细胞培养液制备 (1)把HeLa细胞铺在装有DMEM-10%FBS培养液的直径为35mm的玻璃皿上。 (2)在37°C(5%二氧化碳)保育,直到50%~80%细胞汇合。 (3)使用Genejuice(Novagen),将含钙变色子的哺乳细胞表达质粒转染细胞。 (4)6h以后移除转染混合液,代之以1.5ml的DMEM-10%FBS培养液。 (5)在37°C(5%二氧化碳)保育24h。能完成Ca2+成像实验的细胞已备好。 4.3.3.2数据采集 实验应该在暗室中完成,以减少背景光。图4.5显示我们使用的显微设备。 (1)打开氙灯、显微镜、滤光转换器和计算机。 (2)从培养皿中移除培养基。 (3)用1mlHBSS(+氯化钙)清洗。 (4)加入1ml新鲜的HBSS(+氯化钙)。 (5)把细胞放在显微镜台面上。 (6)启动MetaFluor软件。在采集数据时,MetaFluor软件控制快门、滤光转换器和照相机。 (7)用目镜挑选YFP荧光,以发现表达钙变色子的细胞。把滤光指示转到U-WNIBA带通直角镜位置,并根据荧光发射水平,使ND滤镜在0.1%~10%。U-WNIBA直角镜对使用目镜快速发现YFP荧光细胞很实用,而10%ND滤镜是用来防止光褪色。 (8)使用40X油物镜,把显微视场中心移到外观健康、并呈现强胞质体荧光的细胞上。图4.6是显示健康HeLa细胞典型荧光分布的画面。 (9)用MetaFluor在计算机荧屏上逐幅采集图像,同时调节聚焦直至得到最清晰的图像。 (10)把滤光指示转到CFP-YFP FRET直角镜位置。 (11)为监控作为CFP对时间的峰值激发的结果的CFP和YFP的峰值激发,课置如下数据采集条件:时间间隔大于10s;对CFP和YFP,曝光时间200ms。MetaFluor会显示发射比随时间的变化。 (12)在CCD图像上选择一块感兴趣的区域。通常这个区域要涵盖感兴趣的细胞。然后开始数据采集。在感兴趣的区域内的CFP和YFP的荧光发射强度,和它们的发射比一起,会得到实时监控(见注8)。 (13)当发射比达到稳衡态,向培养皿中加入50μl12mmol/L组胺,使终浓度大约为100μmol/L。操作过程要小心,不要移动培养皿。组胺结合到质膜上的受体上,启动信号级联,使Ca2+从内质网通过肌糖-1,4,5-三磷酸受体释放[10,11]。这将会引起钙变色子的构象变化,因YFP发射强度增加CFP强度减弱而被观察到。因而,发射比应该增加。当组胺作用消退后,发射比应该减退到稳衡态水平。图4.6显示MetaFluor软件在采集数据时的一幅荧屏照片。 (14)为使发射比与胞质体[Ca2+]相关联,必须测定Rmin和Rmax,以便把发射比映射到Ca2+结合曲线上。加入50μl的20μmol/L离子霉素,使终浓度近似为1μmol/L。离子霉素在质膜上把通道打开,以让Ca2+渗过。由于培养基的氯化钙饱和,发射比会升高到Rmax。为测定Rmin,加入50μl100mmol/L的EGTA和600μmol/LBAPTA-AM,使终浓度分别近似为5mmol/L和30μmol/L。发射比应该会降到Rmin。 (15)停止数据采集。 |
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发布于 : 2018-08-07
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