哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的测定实验
| 实验材料 | 用感兴趣的DNA转染的哺乳动物培养细胞 试剂、试剂盒 | 细胞裂解缓冲液荧光素酶测定缓冲液荧光素溶液不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液 仪器、耗材 | 荧光光度计和光度计测置管橡胶棒 实验步骤 |  材料 缓冲液和溶液 贮存液稀释到适当浓度。 细胞裂解缓冲液 25mmol/L双甘氨肽（pH7.8) 15mmol/LLMgSO4 4mmol/LEGTA 1%(V/V)TritonX-100 临用前加入1mol/LDTT贮存液，终浓度为1mmol/L。 测定每个100mm培养皿中的细胞大约需要1ml细胞裂解缓冲液。 荧光素酶测定缓冲液 15mmol/L磷酸钾（pH7.8) 25mmol/L双甘氨肽 15mmol/LMgSO4 4mmol/LEGTA 2mmol/LATP 临用前加入1mol/LDTT贮存液，终浓度为1mmol/L 每个荧光光度计测量管大约需要400ul荧光素酶测定缓冲液。 荧光素溶液 25mmol/L双甘氨肽 15mmol/LMgSO4 4mmol/LEGTA 0.2mmol/L荧光素 临用前加入1mol/LDTT贮存液，终浓度为2mmol/L。 每个荧光光度计测量管大约需要200ul荧光素溶液。荧光素溶液中加入1~2umol/L辅酶A会使发光更强和更持久（Wood1991)。 重要：荧光素是能够受荧光素酶催化发光的底物的通称。常用的荧光素酶基因来自萤火虫，它作用于特定的荧光素底物。其他如来自海三色堇或某种海洋细菌的荧光素酶所使用的荧光素底物具有不同的化学性质。确定前面缓冲液中所用的荧光素底物确实与表达质粒中的荧光素酶基因相匹配。 不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液（PBS) 特殊设备 荧光光度计和光度计测置管 橡胶棒 细胞和组织 用感兴趣的DNA转染的哺乳动物培养细胞  方法 1.转染后24~72h,室温下用不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液（PBS)洗细胞3次。PBS换液时要轻缓，因为有些哺乳动物细胞（如人胎肾293细胞）在剧烈吹打时很容易从培养皿上脱落下来。 通常，荧光素酶基因在转染细胞中获得最大表达量的时间是24~72h,请看栏目荧光素酶活性测定的优化的内容。 2.每个100mm培养皿中的转染细胞，加入lml冰冷的裂解缓冲液。缓冲液轻轻旋转,然后用橡胶棒把裂解细胞从培养皿上刮下来。细胞裂解物转移到1.5ml离心管中。 3.细胞裂解物在4°C以最大速度离心5min。把上清小心地转移到另一个新的1.5ml离心管中。 4.用Bradford测定等快速比色法确定裂解物的蛋白浓度。在测定蛋白浓度前，为了防止干扰，把TritonX-100的浓度稀释到小于等于0.1%。 这步中，细胞裂解液可以分成小份,贮存在-70°C。虽然贮存在或-20°C时，荧光素酶在裂解缓冲液中不稳定（Brasieretal.1989),但是在含15%(V/V）甘油和1%（m/V)牛血淸白蛋白的缓冲液中，该酶可以在4°C安全贮存。 5.敲打盛有裂解物的管子的管壁，轻轻使裂解物混合。室温下，在每个含有360ul荧光素酶测定缓冲液的荧光光度计管中加入5~200ul细胞裂解液。管子放入荧光光度计。 除了可使用荧光光度计测量荧光素酶活性，还有另一种方法在栏目替代方案：用闪烁计数器测量荧光素酶活性。 6.测定开始，200ul荧光素溶液加到荧光光度计管中，然后在室温测量2~60s时间内的光输出。 測光输出时间的最佳长短要根据经验确定，而且与转染细胞的类型以及所用的特殊底物和荧光素酶有关。 7.测定每个管子产生的相对光单位数，并确定测量的线性范围。使用适当量的细胞裂解蛋白，使它在随后测量中产生的值位于线性范围的中部。根据所研究启动子的强度以及每次实验的转染效率，所需蛋白的量会有变化。细胞裂解物中荧光素酶活性可以用相对光单位数或毫克表示。    |
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发布于 ： 2021-08-02
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