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这本实验教材是为生物科学与生物技术专业的细胞生物学教学而编
写,适用于该专业五年制本科等学生使用。
细胞生物学实验课的教学目的,主要是通过基本技能训练及观察分析
实验结果,使学生了解掌握有关的实验技术原理和操作方法,进而提高学
生动手实践、观察分析和解决问题的能力。基于生物技术专业的学生已完
成基本的实验操作训练,本套实验内容自成体系,着眼于提高学生的专业
技能训练,及观察分析问题和科学思维能力的培养。全部实验采用活细胞
为材料,由学生自己动手取材和实验,使学生能对细胞获得主动的认识,
选编了生物医学常用的细胞生物学科研技术,如细胞的原代和传代培养、
细胞的冻存与复苏、细胞凋亡的实验观察、基因表达载体的构建、基因的
表达与定位检测等,为学生日后的实际科研工作打下基础。
全书内容共六个实验,分三次授课,共计24学时,与理论课授课内容
相辅相成,互为补充。所有实验由学生自己动手操作,少数应用大型精密
仪器的内容进行示教。
本教材由细胞生物教研室方瑾、邵阳光、张惠丹、李想、刘芙蓉等教
师及教辅人员参与编写,均具有丰富的理论和实验课教学经验。由于经验
不足,本教材还有很多亟需改进之处,敬请使用者批评指正。
中国医科大学
细胞生物教研室
2006年9月
目 录
实验一 培养细胞的形态观察和计数……………………………………1
实验二 细胞的冻存与复苏………………………………………………5
实验三 细胞的原代和传代培养…………………………………………7
实验四 放线菌素D诱导HL-60细胞凋亡的实验观察……………… 11
实验五 含有目的基因真核表达pEGFP-C1载体的构建………………15
实验六 目的基因在真核系统中的表达及细胞内的定位………………24
实验一 培养细胞的形态观察和计数
实实验验一一 培培养养细细胞胞的的形形态态观观察察和和计计数数
【实验目的】
1.了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态
2.掌握细胞计数的基本方法
【实验用品】
1.材料和标本
培养中HeLa 细胞、NIH3T3、HL60细胞
2.器材和仪器
倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管、盖片
3.试剂
0.3%台盼兰染液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液
【实验原理】
体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细
胞,如HeLa细胞、NIH3T3等,叫贴壁型细胞,体外培养的细胞大多属于
这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上,而是悬浮在培养液中生长,
如HL60细胞,叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血液原性或癌原性细胞。
在细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞的鉴定和
细胞的计数、调整细胞的密度,是进行实验不可缺少的
一种基本技能。
【实验内容】
一 培养细胞形态观察
1.将细胞培养瓶从37ºC二氧化碳培养箱(或温箱)中取出,瓶口稍稍向上
倾斜以免瓶内液体接触瓶塞或流出瓶口,注意观察细胞培养液的颜色和清
澈度。然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。
2.打开倒置镜光源,用10X物镜观察,通过双筒目镜将视野调到合适的亮
度,并调节双目镜的光瞳间距,使左右两个视场象合而为一。
3.调节载物台高度进行对焦,在看到细胞层之后,用细调节器将物像调清
楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时,经常使用的是十
倍的物镜。
4.结果
贴壁细胞一般有两种形态,即上皮细胞型和成纤维细胞型细胞。上皮细
胞型细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连
接成单层细胞片,如HeLa 细胞。成纤维细胞型细胞形态与体内成纤维细
胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质向外伸
出2~3个长短不同的突起,细胞群常借原生质突连接成网,细胞生长时多
呈放射状或漩涡状,如NIH3T3。
贴壁细胞在生长状态良好时,细胞均质而透明,细胞内颗粒少,看不
到空泡,细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培