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心肌细胞流式检测AV/PI个人经验

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原代培养细胞，关键是消化，我一般酶液是新配的，要足量啊（又一次还剩三排的时候，一同学把酶液碰到水浴锅，害的我借得酶液，耽误了时间，而且组间数据紊乱，最后浪费细胞和染料，大家要注意保护好酶液啊），这样每次心理都有底，而且放入水浴37度30min，甚至扔到培养箱（不建议采用）升温。消化前，用温PBS轻洗细胞，一次，然后开始消化，24孔板加400ul酶液（0.25%胰酶和0.02%edta，如果你的edta不好，那么配好就用0.22或0.45um膜过滤），先镜下观察，放入培养箱10s，后再看，一般够了，不过正常组可能需要20-30s。然后我就轻拍手，帮助消化，镜下看细胞，飘起70%-80%，每孔加10%FBS培养基终止消化，轻吹打，孔四周和中间（俺的细胞就是中间多）。吸入流式管。离心1000转7min，其实要根据离心机质量来考虑，如果进口的就用这个设置，国产的启动和降速太慢，而且转速不确定。小心果断干脆快速的倒上清，加已经按1：4稀释的AV5ul（省染料）和10ulPI，避光温度稍低些，现在天热了，15min，加buffer400ul，上样。成年心肌上样前的状态是关键，就是刚分下来和处理的一段时间。所以PI肯定很多，而且离心要科学，不要用PBS，虽然是缓冲液，至少要调PH值，如果做与钙无关的实验，可以试一试无钙的胞外液，kb液是非正常生理液，AV可以先用buffer稀释1/4使用，否则太浪费。上样最好紧接染色之后。染料是伤细胞的，尤其对于急性分离的心肌细胞，离心后弃上清也是有技巧的，否则上清留下来，要么细胞丢失。