荧光原位杂交的染色体分析 （一）标本的制备 1．室温下，依次用70％、90％和100％的乙醇脱水5min。 2．空气干燥载玻片。 3．若短期使用，载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存，应在室温下过夜使组织“老化”（aged），然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋内，－70℃保存。根据作者的经验，在6个月内使用的载玻片可贮存在－20℃。在杂交实验之前解冻这些载玻片，不提倡反复冻融载玻片。 （二）缺口平移法标记探针 通过缺口平移法生物素（酰）化DNA探针 1．结合：2μg探针DNA，10μl10×反应缓冲液，10μlβ－巯基乙醇，10μl核苷酸母液（含0.5mmol/LdATP,0.5mmol/LdCTP,0.5mmol/LdGTP,0.5mmol/L生物素-16-dUTP和0.12mmol/LdTTP），20单位DNA聚合酶I和1：1000稀释的DNaseI，加双蒸水至100μl（最后加酶）。 2．在15℃温育2h。 3．置反应混合物于冰浴直至反应产物的大小被确定。 4．凝胶电泳检测探针分子的长度：取10μl反应混合物，加入凝胶上样缓冲液，水浴箱中煮沸2～3分钟使其变性，冰浴3min，上样到1～2％的琼脂糖微型凝胶中，并以适当大小的标准品做对照，以50V/cm电泳3min。用浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭染胶，在紫外透照仪上显示DNA并拍照。 5．对于最佳的杂交条件，探针（可见一脱尾）应为100～500nt。根据电泳结果进行下述步骤： a.如果探针大小在期望的范围内，进行步骤6。 b.如果探针太大，可加入更多的DNaseI，在15℃温育。 c.如果探针未完全消化，纯化探针并重复缺口平移法。 d.如果探针太短，用较少的DNase重复反应。 6．为使DNase失活，加入2μl0.5mol/LEDTA和1μlSDS，在68℃加热10min。 7．用离心柱凝胶过滤法从标记的探针中分离出未掺入的核苷酸： a.用1ml注射器装入硅胶玻璃棉至0.2ml刻度处，加经缓冲液平衡的SephadexG50至1ml刻度处，将此柱置15ml的离心管内，室温下，3000r/min离心6min。 b.去除过柱后的液体，加入缓冲液重复离心直至柱内容物紧密充填至1ml刻度处，加100μl柱缓冲液，3000r/min离心6min，重复洗涤步骤3次。在最后一步洗涤后，确保流量与上样缓冲液量相等，即100μl。 c.探针溶液离心之前，放1.5ml的反应管在注射器下方的15ml管内，与前面步骤相同，加探针液到柱内并离心，过柱后的液体收集在反应管中，这时已含有20ng/μl的标记探针。该探针已可用于原位杂交或贮存于－20℃。 用缺口平移法进行地高辛标记 与缺口平移地生物素化法几乎相同，仅10×寡核苷酸母液成分不同： 0.5mmol/LdATP,0.5mmol/LdCTP,0.5mmol/LdGTP,0.125mmol/L地高辛-11-dUTP，0.375mmol/LdTTP。 （三）斑点印迹分析法检测标记物 1．将分装的1μl标准DNA稀释液和同法配制的1μl待测DNA稀释液点于硝酸纤维素膜上。 2．硝酸纤维素膜置80℃真空烤箱内1h。 3．室温下，用AP7.5缓冲液漂洗硝酸纤维素膜1min。 4．将硝酸纤维素膜密封于含10ml封闭液的塑料袋中，置37℃温育30min。 5．打开塑料袋的一端，弃去封闭液，加入新鲜配制的链亲和素-碱性磷酸酶交联物溶液，重封塑料袋口，置37℃温育30min。 6．从塑料袋中取出硝酸纤维膜，用AP7.5缓冲液漂洗（室温下两次各5min），再用AP9.5缓冲液漂洗（室温下10min）。 7．将硝酸纤维素膜重封于含显影液的塑料袋中（33μlNBT溶于10mlAP9.5缓冲液中）。小心混匀后（不可漩涡混匀！）加入25μlBCIP，再次轻轻混匀反应液，在37℃温育直至显影达满意程度，一般15～60min。 8．从塑料袋中移去硝酸纤维膜，用TE缓冲液终止显色反应。 9．空气干燥后，评估分析结果：测试组和对照组DNA的颜色密度应进行比较。在理想的杂交结果，最低稀释度信号应当是可见的。 （四）荧光标记原位杂交探针的混合与变性 1．混合20～60ng单拷贝DNA和3～5μg经剪切的鲑精DNA（作为载体）。如果反应后体积少于10μl，可冻干；若体积较大，可加入1/20体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积100%乙醇使DNA沉淀。混匀并置－70℃30min。在4℃用Eppendorf离心机以12000r/min离心10min，弃上清，沉淀物以500μl70％乙醇漂洗后再离心（4℃，12000r/min,10min），弃上清并冻干。 2．重悬于5μl去离子的甲酰胺中，于室温漩涡混匀数分钟。 3．加5μl杂交缓冲液，漩涡混匀5～10min。 4．在75℃使DNA探针变性5min，接着冰浴5min，这时探针已可用于杂交。 （五）载玻片上DNA变性 变性 1．在载玻片上选择合适的杂交区，用铅石笔在载玻片的另一面作记号。 2．变性前将载玻片置60℃烤箱孵育以防止变性液加至载玻片时温度的降低。 3．加变性液至Coplin广口瓶内，在水浴箱中加热至70℃，用置于瓶内的温度计检测变性液的温度（这是关键步骤！）为得到好的结果，温度应达70℃。 4．将预热的载玻片（一次不多于3片）移至含变性液的Coplin广口瓶内准2min。 5．立即将载玻片依次移入含70％、90％和100％乙醇（冰冷）的Coplin广口瓶内，各5min。 6．空气干燥后，载玻片已可用于杂交。 杂交 1．将10μl含变性探针的杂交混合物加至载玻片的变性靶DNA上。 2．在杂交的液滴上小心地盖上18×18cm的盖玻片，不要滞留气泡。 3．用橡皮泥将盖玻片四周封好，置载玻片于湿盒内，37℃温育过夜。 （六）检测 1．分别在42℃和60℃的水浴箱内预热漂洗液A（50％甲酰胺，2×SSCpH7.0）和B（1×SSC～0.1×SSCpH7.0）。 2．从湿盒内取出载玻片，用镊子小心除去橡皮泥。 3．置载玻片于含预热至42℃漂洗液A的Coplin广口瓶中，在水浴箱中振荡10min直至盖玻片脱落，将载玻片移至另一含漂洗液A的广口瓶中，振荡5min，更换漂洗液A两次，每次振荡5min。 4．将载玻片移入含预热（60℃）漂洗液B的Coplin广口瓶中，漂洗5min，更换漂洗液两次，每次漂洗5min。 5．将载玻片从Coplin广口瓶中取出，弃尽液体，加200μl封闭液，盖以22×40mm的盖玻片，置湿盒内，37℃温育至少30min。 6．从每张载玻片上移去盖玻片，去除过的的液体，加200μl带荧光的报道分子检测液（如5μg/ml与荧光素偶联的亲和素或6μg/ml与罗丹明偶联的抗地高辛抗体），在37℃湿盒内温育30min。所有的后序步骤均应在避光的Coplin广口瓶中进行（如外裹锡箔纸）。 7．移去盖玻片，将载玻片移至漂洗液C（4×SSC，0.1％Tween20pH7.0）中，在42℃（振荡水浴箱）漂洗三次各5min。 8．将载玻片置入含复染剂（如2×SSC，200ng/mlDAPI）的Coplin广口瓶中，室温振荡20min。 9．将载玻片移至漂洗液D（2×SSC，0.05％Tween20）的Coplin广口瓶中，室温中温育1～2min。 10．从Coplin广口瓶中取出载玻片，加20～30μl防退色液并盖以22×40mm的盖玻片，置载玻片于合适的盒内，以便4℃长期保存。 （七）染色体原位抑制（CISS）杂交 1．结合适量标记的探针DNA，人竞争DNA（Cot1片段）2～4μg，加鲑精DNA至总量为10μgDNA。 2．加1/20体积乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇使DNA沉淀，置－70℃30min。12000r/min离心10分钟后，大多数可见沉淀。弃上清并用70％乙醇漂洗，再离心弃上清。 3．冻干样本，重溶于5μl去离子甲酰胺中。 4．加5μl变性缓冲液。 5．在75℃温育5min使DNA变性。 6．迅速将含探针溶液的微量离心管移至37℃，温育5～20min（甚至更长）使部分DNA再退火。 7．预退火的探针与变性DNA在载玻片上混匀。 8．继续进行（四，五，六）所述的步骤。 （八）信号放大 1．小心地从载玻片上移去盖玻片。 2．将载玻片移至漂洗液C（4×SSC，0.1％Tween20pH7.0）中，在42℃漂洗三次共10min。 3．从Coplin广口瓶中取出载玻片，吸去载玻片上的残液，加200μl含1～5μg/ml生物素化的抗亲和素抗体的检测缓冲液，覆以22×40mm的盖玻片，置湿盒内在37℃温育30min。 4．在42℃含漂洗液C的Coplin广口瓶中漂洗载玻片三次各5min。 5．从Coplin广口瓶中取出载玻片，吸去载玻片上的残液，加200μl含5μg/ml偶联荧光染料的亲和素检测缓冲液。 6．漂洗和染色体步骤见（六）。 （九）多色荧光标记原位杂交 1．在DNA沉淀之前，采用几种与不同报道分子结合的探针，而不是仅用一种探针。 2．合适的报道分子结合物必须加到检测缓冲液中（六）。每种报道分子结合物应与一种荧光染料结合，该染料在光谱上能与同一实验所用的其它荧光染料相区别。
