【求助】ECL发光法背景高怎么办?
2021-07-22
问题描述：
本人最近一直在做WESTERNBLOT，一直按照同学教我的方法进行，虽然可以看到我的目的条带，但是背景很高，不知道问题出在哪里，我说一下的操作步骤，希望园里高手指导！
配胶、上样、跑胶、半干转无特殊，半干转后，就用TBST浸润一下后放入封闭液（试过5%牛奶、5%BSA）2小时，后取出直接抗体孵育（目标蛋白抗体1：1000、1：1500、1：2000【建议浓度1：1000-3000】，二抗1：2000、1：3000、1：5000【建议浓度1：1000-5000】，内参beta-actin差不多，目标蛋白4度过夜，内参室温2小时），孵育完后，TBST洗三次，每次10min，后二抗孵育，完后同样TBST洗三次，每次10min，后进行ECL发光液浸润2min，暗室压片2min(主要问题是在暗室中可以看到整张PVDF膜都有荧光，郁闷），显影定影，结果在胶片PVDF膜位置很黑，虽然可以见到我的条带，但是无法使用，不知道究竟怎样解决？（实验室另一位同学不存这样的问题）
试过几次都是同样的问题，是封闭的不好？抗体稀释度不够？TBST洗得不好？ECL发光步骤问题？渴求园里战友指导，谢谢！
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kuxs112
用户
可以考虑封闭是不是不好；是不是有加一抗、二抗时气泡多？可以试着降低二抗浓度；发光液加的太多，不知你用的那种发光剂，有可能不佳敏感；曝光时可以从30s开始，摸摸条件。
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华之风
用户谢谢，我一直怀疑封闭的问题，主要是实验室同学亦是如此封闭，让我很是郁闷，我再试试加长封闭时间，加抗体有没有气泡太多，我没有注意，下次一定注意，谢谢提醒；发光液我用的是碧云天的，混合后1ml，滴加浸润2min，暗室中观察整张膜都有荧光，感觉就不对了，曝光时间我再摸摸条件，很感谢！
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yangpo909
用户背景过高，一般考虑封闭和一抗二抗问题。封闭可以考虑换用5%BSA，延长封闭时间。一抗可以试一下1：4000，1：5000，可以试一下。二抗再稀释一下，楼主可以多试几次。我们实验室也遇到过这种情况，他们就是稀释一抗和二抗。还有一种情况就是一抗特异性不好，这个是一抗原因，解决办法就是换掉一抗，用其它公司的试试。祝好运！
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xinhailicheng
用户另外，你半干转的条件是什么啊？说一下，也许大家可以更还解决你实验中的问题？
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tony1982
用户1.适当减少减少上样量2.5％脱脂奶粉，4度过夜封闭3.二抗用1：5000，适当缩短二抗孵育时间，可以室温一个小时4.ECL工作液加上后，只要目的条带出来了，就不用继续浸润了5.缩短曝片时间有些多抗不太好做，需要反复摸索。
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jimao007
用户我告诉你……你多花一点钱，买Pierce的……保证不会了
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华之风
用户谢谢各位的指导，明天试一试，看看情况
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kuxs112
用户我用的MILLPORE的发光液，现在搞活动，三百多块钱。敏感度挺高，用时可节省，少用。还是比较划算的！二抗稀释度很大，要摸条件。楼上几位说的都很有道理，试试吧。祝好运！
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kuxs112
用户我用的MILLPORE的发光液，现在搞活动，三百多块钱。敏感度挺高，用时可节省，少用。还是比较划算的！二抗稀释度很大，要摸条件。楼上几位说的都很有道理，试试吧。祝好运！
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kuxs112
用户我用的MILLPORE的发光液，现在搞活动，三百多块钱。敏感度挺高，用时可节省，少用。还是比较划算的！二抗稀释度很大，要摸条件。楼上几位说的都很有道理，试试吧。祝好运！
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kuxs112
用户我用的MILLPORE的发光液，现在搞活动，三百多块钱。敏感度挺高，用时可节省，少用。还是比较划算的！二抗稀释度很大，要摸条件。楼上几位说的都很有道理，试试吧。祝好运！
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lilyvalley
用户我用碧云天的ECL工作液，没有整张膜发荧光的情况。你加完工作液，浸润2min后，有没有用吸水纸把工作液吸掉？觉得你的问题在这里。
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jzlian
用户顺便问下PVDF是不是用ECL显色经常会背景比较强的？
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40407321lhy
用户一般背景高和一抗浓度有直接关系，下次在做可降低抗体浓度和抚育时间。延长封闭时间。我做最多的时候4度封闭24小时。抗体稀释液可用封闭液稀释，这样可以更好的减少背景过重的原因。在就是压片的时候一定不要时间太长，几秒钟时间，拿出来马上显影，一旦蛋白表达出来后马上放入定影液中。这样也可以减少背景过重。
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40407321lhy
用户一般背景高和一抗浓度有直接关系，下次在做可降低抗体浓度和抚育时间。延长封闭时间。我做最多的时候4度封闭24小时。抗体稀释液可用封闭液稀释，这样可以更好的减少背景过重的原因。在就是压片的时候一定不要时间太长，几秒钟时间，拿出来马上显影，一旦蛋白表达出来后马上放入定影液中。这样也可以减少背景过重。
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saint7878
用户恩，我们实验室也用过碧云天的，当时也是背景很深，后来我们用了Pierce的荧光液做对照，的确要淡很多。当然，也不是说碧云天的不好，各公司的试剂发光效率肯定不一样，可以通过优化条件来解决二抗稀释度。二抗孵育后的清洗次数，建议你再加一次10min，洗四次。荧光孵育时的操作，尽量用滤纸将膜表面的Tbs和发光液洗干。（但还是要保持膜的湿润）曝光时间，我压过曝光10s左右的片子，也压过曝光几小时的片子。
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qinfujun
用户我们一般二抗是1：10000一抗也是1：10000，二抗洗4次，每次15min，一抗4次，每次10min，效果很好，当然。我们用的一抗是UPSTATE的商业化抗体
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