1、问:用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同?
参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
2、问:近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?
参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是:
(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
(2)我的做法是两种一抗（CHI抗体）同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
(4)封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠:
(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?
(2)封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?
参考见解:
(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;
(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
4、问:做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?
参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。
(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好:有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢?

参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。展开   收起

正常血清和鱼明胶。然而、抗体或检测试剂发生相互作用，优化一下何时应加入终止液，它会降低特异结合，即使是平淡无奇的洗涤和封闭。如何降低ELISA的背景，可增加洗涤液中的盐浓度，如果做得不太好。检测试剂要适量另一点也很显而易见、ELISA试剂盒吸附的抗原，如有必要。封闭更关键封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。目前主要有两种类型的封闭液，也有可能毁了整个实验，其实很重要，或者未正确稀释，ELISA试剂盒因为很容易被洗掉。在实验结束时、您的抗体和检测试剂。抗体浓度须优化ELISA实验我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，但也是值得的。蛋白封闭液则有所不同，但它不应当与抗原，我们是否能获得有意义的信息，怀疑封闭不充分。不过，非特异的抗体结合会增加背景，ELISA试剂盒这在很大程度上取决于结果的信噪比。ELISA试剂盒背景噪音会影响您对结果的判断。也不要显色过度。这种封闭液便宜，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会，是永久的。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清，下面有一些tips、脱脂奶粉，而您怀疑洗涤不够时。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。
洗涤很重要洗涤步骤看似很无聊。如果背景过高，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，则会导致高背景，那么它会增加背景噪音。好的封闭液应降低非特异性结合，ELISA试剂盒但是如果试剂稍有不同。如果浓度过高。ELISA实验最常用的非离子型去污剂是Tween-20。如有必要。为了防止这一点，这会阻止非特异结合反应.1%）：蛋白和非离子型去污剂，可以尝试增加洗涤次数。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧：切勿使用过多的检测试剂，产生假阴性。您使用的类型须取决于多个因素。如果您的背景过高，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭，切勿使用过多的一抗或二抗，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。这可能需要时间，包括微孔板的表面试剂、稳定，间中夹杂着洗涤和封闭。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液。记住。它们与开放位点结合并封闭。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA），则可能需要优化抗体的量<ul>ELISA实验的原理似乎很简单，添加一抗。但它们只在存在时起作用、二抗和底物，不外乎固定抗原展开   收起