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Taq DNA Polymerase 和rTaq酶有什么区别
第一代热启动Taq酶是一种DNA聚合酶。 第一代指的是直接从Taq（这是一种细菌）体内提取的天然聚合酶，没有进行化学修饰的，为了达到更好的聚合催化效果，往往需要经过酶工程处理，得到的聚合酶催化效率更高。 热启动是指这种酶的反应温度条件
Taq DNA polymerase是从克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经过柱纯化分离出来的一个约94 KD的重组蛋白。无外源核酸酶和细菌DNA污染，稳定性好，特异性强，适用于常规PCR扩增。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶）,它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。向左转|向右转
基因克隆技术
摘要：随着转基因技术的发展，获取目的基因片段的方法也越来越多样化，获取目的基因片段的技术也日新月异，但是无论获取的方法和手段怎么样发展，获取的主要思路始终在围绕一根主线在开展。
关键词：基因 ，遗传效应，基因克隆，体外重组
一、基因工程
基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。
基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。
基因工程( 又称DNA 重组技术、基因重组技术) , 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。 基因工程研究内容为：
(1) 从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段。
(2) 在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。
(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。
(4) 从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。
基因工程中聚合酶不是基本酶的原因：DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸加到原有的DNA片段上的，所以不用！DNA聚合酶是不论何种片段强制连接的，而聚合酶是连接有特定顺序的碱基对片段的DNA。基因工程常见几种酶比较：DNA聚合酶： 在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。DNA解旋酶： 在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂 DNA水解酶： 在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键。DNA连接酶：在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。
解释酶的活性部位？必须基因及两者关系？
目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等.1.化学修饰法：此方法是研究最早,应用最广泛的方法.原则上讲,酶分子侧链上的各种基团
A、酶的本质是绝大多数酶是蛋白质，所以绝大多数酶是基因转录和翻译的产物，A错误； B、细胞核基因是染色体的组成部分，细胞质基因不是染色体的组成部分，酶不是细胞内染色体的组成成分，B错误； C、基因可以通过控制酶的合成控制代谢进而控制生物的性状，C正确； D、有某种酶的基因，细胞中不一定有相应的酶，因为在细胞中基因是选择表达的，D错误．故选：C．
‘控制’这个说法其实是个广泛的表述。实际上，DNA只不过是一个模板，通俗说是没有化学活性意义的母本，要转录翻译成为蛋白质，就要先转录成mRNA，然后mRNA作为最后的模板，翻译出想要得到的蛋白质，这之后，通常对得到的蛋白质进行进一步修饰才会得到最后由化学活性意义的蛋白质产物。当然这个步骤很复杂，远远不是说得这么简单，讨论他们都是化学分子组成的同类这一点没有意义的，就像你的手的行为有大脑控制的，而你的手和大脑都是蛋白质组成的。。。这个逻辑关系实际是宏观和微观的关系，朋友千万不要把这些混淆了去钻牛角尖。如果有兴趣和能力学量子物理，你就都明白了。。。祝学习愉快。
20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶）。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。
限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快，已提纯的限制性核酸内切酶有100多种，许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅰ型和Ⅲ型酶具有限制和修饰两种作用，而特异性弱，切割位点的序列不固定，不已知，不宜用于基因克隆中。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。
（一）从源头控制污染：
（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。
（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂
（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。
（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。
作为生物体四大有机分子之一,糖的代谢是整个生物代谢的中心。它既是植物的生长发育过程中重要的结构组分,又是一种细胞间用于通讯的信号分子。糖类的代谢主要包括合成、修饰、分解等过程,参与这些过程的酶根据功能不同各司其职。如糖类的合成需要糖基转移酶(glycosyl transferases);糖类的修饰需要糖脂酶(carbohydrate esterases);分解则需要糖苷水解酶和多糖裂解酶(glycoside hydrolases and polysaccharide lyases)等。 糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)亦称为糖苷酶,是作用于各种糖苷或寡糖使糖苷键水解的酶类总称。根据氨基酸序列,可以将糖苷水解酶划分为130个家族(GHs),但是至今仍有很多基因没有被分到任何一个家族中。拟南芥基因组中已鉴定出401个糖苷水解酶基因,分别属于35个不同家族。糖苷水解酶作为糖类代谢的关键组分,其生物学功能得到了广泛的研究。 本文利用反向遗传学,借助遗传转化和RT-PCR等生化和分子生物学手段,研究了拟南芥中两个新的类糖苷酶基因AtGHL1和AtGHL2的生物学功能。研究发现: 1.通过生物信息学分析,AtGHL1和AtGHL2两个基因的核苷酸及氨基酸序列同源性达90%以上,其编码蛋白均有糖苷酶特有的DUF1680复合结构域和类6-发卡糖苷酶,但这两个基因没有被归属到目前分类的任何糖苷酶家族中,为两个新型的类糖苷水解酶。 2.通过PCR鉴定及RT-PCR检测,分别获得了AtGHL1和AtGHL2的基因缺失突变体ghl1和ghl2;通过RNAi载体的构建及遗传转化,获得两个基因表达均下调的转基因植株ghli。表型检测发现,各突变体均存在雄蕊缺失的现象,表明AtGHL基因可能参与了雄蕊发育的过程。 3.根据拟南芥遗传转化株中报告基因GUS和YFP的表达,发现这两个基因主要在幼苗、莲座叶及花等器官的输导组织中表达。亚细胞定位结果显示,AtGHL定位于细胞壁。 4.通过糖饥饿胁迫及RT-PCR检测,发现AtGHL基因转录受糖饥饿的诱导。在不含蔗糖的MS培养基中,突变体ghl1和ghli幼苗生长受到严重影响,存活率仅为20%。
限制性核酸内切酶(以下简称限制性酶)是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA，产生5’-P和3’-OH末端。 1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。Arber及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，据此他们提出了限制 - 修饰酶假说。对于一个宿主细胞，限制性酶及 DNA甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对DNA底物有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子内部拆卸水解，甲基化酶是修饰，DNA分子经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，而甲基化酶只修饰宿主自身的DNA，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。
限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在 DNA链上没有固定的切割位点，一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点，但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。
2.识别序列及消化产物的末端结构 限制性酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称回文序列，如EcoRI的识别序列为：
GAA
TTC
横轴
CTT
AAG
纵轴
将纵轴一侧的序列以横轴为中心旋转180°，则纵轴两侧的序列相互对称，这种结构又称为双重对称结构。大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。4核苷酸序列在DNA链中出现频率高，对一随机排列的DNA分子来说，理论值为1/44，因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多，产生片段的数目多，长度短，显示出酶的特异性较低。对于5和6核苷酸识别序列的酶，出现频率分别为1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出现频率低，酶的特异性强，而8核苷酸识别位点在DNA链中出现机率更低(1/48 )，特导性更强，可提供更长的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列，其回文识别序列被个或几个其他核苷酸所间隔，如BglⅠ，这种酶的特异性比识别长度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(约10种，如BbVⅠ等)，其识别序列不表现为回文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。
限制性酶切片段的末端结构：限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割 DNA链时，总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’末端则为游离羟基。因此某一种酶的全部产物的末端具有相同的结构。根据切点序列的结构特点，产物的末端可分为粘性末端和平末端两类。粘性末端指酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补性，突出的单链因部位的不同，又可分为5’-与3’-粘性末端两种，突出的单链带5’磷酸单酯的称5’-粘性末端，而突出的单链含3’-羟基则称3’-粘性末端。平末端指酶切后，片段为齐头末端结构。在DNA体外重组时，粘性末端是DNA连接酶的有效底物，有很高的连接效率。向左转|向右转
