一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

乙醇

去除RNA酶的双蒸水

2.核酸和寡核苷酸

DNA模板（0.5~1.0ug线性化的质粒模板或0.1~0.5ugPCR模板）

3.放射性复合物

[a-32P]ATP(10mCi/ml)(lCi=37GBq)

4.实验器材

RT-PCR竞争子构建试剂盒（Ambion;包括T7RNA聚合酶、10倍的转录缓冲液、5倍的NTP溶液、MnCl2、DNA酶I、凝胶上样缓冲液、探针洗脱缓冲液）

二、方法

1.室温下准备转录反应，按下列顺序添加试剂。

10倍的转录缓冲液                  2ul

5倍的NTP溶液                                        4ul

DNA模板                          1~5ul

[a-32P]ATP(10MCi/ml)                                0.4ul

T7RNA聚合酶                      2ul

2.轻弹管子混匀试剂，简单离心，收集反应混合物于管底。

3.37°C孵育转录反应2~4h。

4.从每种样品中取出1ul,用于以后的竞争子浓度测定。

5.在转录反应混合物中加入40ul探针洗脱缓冲液和200ul乙醇。

6.-80°C孵育20min。

7.4°C最大转速离心，沉淀转录反应产物。

8.吸走上清液，用70%的乙醇清洗沉淀并在空气中干燥沉淀。

9.用16ul去除RNA酶的双蒸水溶解沉淀。

10.95°C热变性重悬的沉淀（其中含有DNA模板和被转录的RNA)2min。

11.加入2ul10倍的转录缓冲液和2ul去除RNA酶的DNA酶I(5U/ul)。

12.轻弹管子混合反应试剂，离心，收集反应混合物于管底。

13.37°C孵育lh。

竞争子的纯化

14.添加22ul凝胶上样缓冲液Ⅱ到DNA酶I的反应中。

15.95°C对样品进行变性3min。

16.在变性聚丙烯酰胺（6%丙烯酰胺/8mol/L尿素）凝胶上跑样，直到溴酚蓝达到凝肢底部。

17.从凝胶上去掉一个玻璃板，用塑料膜覆盖凝胶，放上X射线片放射自显彩30min~2h。

18.显影X射线片并对齐放在凝肢的下面，用解剖刀或剃刀刀片从凝胶上切下全长RNA转录本。

19.转移凝肢碎块到小离心管中。加300ul探针洗脱缓冲液，通过简单离心浸没碎块。

20.37°C孵育过夜。

21.扔掉管中的丙烯酰胺凝胶碎块，加入600ul乙醇包含RNA转录本的探针洗脱缓冲液。

22.-80°C孵育20min。

23.4°C最大转速离心15~20min。

24.用70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥。

25.用15ul去除RNA酶的双蒸水溶解沉淀。

竞争子RNA定量

26.转移1ul转录反应物和1ul纯化的竞争子RNA到闪烁管中，加入闪烁液，闪烁记数。

27.使用记数结果，用下面的公式计算出竞争子的浓度（umol/ul或拷贝/ul)。

竞争子RNA(umol/L)=(1ul纯化的竞争子RNA的cpm÷1ul转录反应物的cpm)X(竞争子RNA中的500umol/LATP/A的总量）
竞争子RNA(拷贝/ul)=(1ul纯化的竞争子RNA的cpm÷lul转录反应物的cpm)X(1ul竞争子RNA中3X10¹⁴ATP分子/A的总量）

28.竞争子应以不小于6X10¹⁰拷贝/ul或0.1umol/L的浓度储存在-20°C条件下，保期可达1年。