实时 PCR 的参数实验
| 试剂、试剂盒 | LUX引物单链或双链的DNA或CDNAMg2+dNTP热启动酶 仪器、耗材 | PCR仪
实验步骤 | 一、方法 1.引物 实时PCR的引物必须具有基因的特异性，并能进行较短片段的扩增。 a.LUX引物设计软件（LuxDsigner)缺省的参数已经被设定为可以扩增75~200bp长度的片段，引物退火温度范围为60~68°C,在设置PCR程序时，退火溫度为55~64°C比较合适。该软件设置的参数可以使引物自身互补或引物间形成二聚体的可能降到最低。运用该软件进行引物设计，非常灵活，设计的引物可以橫跨外显子之间的边缘区域或结合区域。 b.通常PCR反应时，引物浓度都是过量的。用LUX引物进行反应时，建议引物浓度用200nmol/L。引物浓度在50?500nmol/L之间时，一般会得,到理想的结果。特别是针对看家基因进行多元扩增时，建议用有限的引物浓度，这样会得到理想的结果。 2.模板 实时PCR的模板可以是单链或双链的DNA,或cDNA,也可用环状DNA(如质粒）。模板浓度通常用10~107拷贝或1pg~10ug。 a.进行实时PCR时，若模板是总RNA或mRNA,浓度通常用1pg~100ng。 b.RNA的纯度和完整性对结果有直接影响。 c.RNA酶和基因组DNA污染是最常见的问题，对RNA纯化时要注意这些问题。 d.RNA酶的存在将会降解RNA模板，导致低估目的基因的表达丰度，而DNA的污染则相反。 e.用横跨外显子之间结合区域的序列设计引物可以避免DNA污染的影响。但这种策略并不都有效，建议在对RNA进行纯化时加入DNaseI。 3.Mg2+和dNTP的浓度 a.1~10mmol/L的Mg2+浓度在一定的目的基因和引物浓度前提下可获得理想的结果，建议通常使用3mmol/L。逬行多元反应时，把Mg2+浓度提高到5mmol/L。 b.理想的dNTP(dATP/dCTP/dGTP/dTTP)浓度是200umol/L。若dUTP替代dTTP，dUTP的浓度应增加到400umol/L。进行多元反应时，把dNTP浓度提高到 400umol/L。 4.酶 建议使用热启动酶。 a.除了模板和引物，公司提供的PCR反应混合物非常方便。对实时PCR来说，建议使用PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG(Invitrogen，11720-025，500Reactions);一步法RT-PCR时，建议使用ThermoScriptOne~Step-System(Invitrogen，11731-023，500Reactions) b.进行多元反应时，为了避免PCR效率降低，50ul反应体系中可以加3U的酶。 5.仪器设备 许多专门的设备都可进行实时PCR,参照用户指导手册进行。下面，针对ABIPRISM7700型号系列检测系统的使用方法进行简要的介绍。 免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
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发布于 ： 2018-08-06
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