通善实时荧光定量PCR服务实验技术服务

基因组DNA提取

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酵母双（单）杂交cDNA文库构建

1.服务流程

1.1客户样品QC

1.2TotalRNA的提取。

1.3mRNA的分离。

1.4以mRNA为模板进行cDNA双链的合成。

1.5对合成的cDNA双链进行分级纯化。

1.6将分级纯化的cDNA与pDONR222载体进行重组反应。

1.7将重组产物转化DH10B感受态细胞。

1.8cDNA文库的QC。

a)检测文库库容量。

b)随机挑取32个克隆子，PCR检测平均插入片段大小，阳性率。

1.9初级文库铺板，抽提质粒

1.10初级文库质粒与PDEST22（或者pGADT7,pGADT7-Rec,pGADT7-Rec2,PCDNA3.1或者其他任意指定

载体，根据客户需求确定载体）载体进行重组反应，电转化，检测文库质量。

a)检测文库库容量。

b)每个文库随机挑取32个克隆子，PCR检测平均插入片段大小，阳性率。

2.送样要求

2.1针对每个文库，客户需提供至少能提取500ug总RNA的样本，或者至少500ug总RNA。

3.发货内容

3.1我们提供构建好的酵母文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基），扩增后初级文库甘油菌，初级

文库中抽质粒，随机克隆子的PCR鉴定图谱，文库构建报告，酵母双杂交筛选相关细胞和质粒。

4.质量标准

4.1文库库容量：大于1*10^7CFU。

4.2平均插入片段：大于1.2Kbp。

4.3阳性率：大于95%。

5.服务时间

30个工作日内

收费：人民币30000.00

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基因甲基化检测

甲基化是在DNA甲基转移酶（DNAMethyltransferase,DNMT）催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中，是最早发现的修饰途径之一，是表观遗传学（Epigenetics）的重要组成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改变DNA的一级结构，但是能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病（如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等）发生过程中发挥重要作用。DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N6-甲基腺嘌呤及7-甲基鸟嘌呤。在高等生物中，5-甲基胞嘧啶多发于CpG二核苷酸序列中，基因组中60%-90%的CpG是甲基化的。在甲基转移酶（DNMT）的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值，但在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子和第一外显子区，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。哺乳类基因组中约存在4万个CpG岛，大多位于转录单元的5’区。CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

服务项目：

1．甲基化特异性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

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特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生甲基化。

2．亚硫酸氢盐测序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，未尾对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

特点：精确度高，能够准确检测出甲基化的程度百分比。

送样要求：

细胞（≥106个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50ng/μl）。

服务价格：