大鼠肝星状细胞培养实验一细胞培养技术
| 实验方法原理 | 选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC，通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定。 | ||||||||
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| 实验材料 | 雄性SD大鼠 试剂、试剂盒 | 戊巴比妥钠小牛血清DMEM酶消化液I、ⅡNycodenzD-Hanks’液HBSS台盼兰 仪器、耗材 | 手术器械尼龙网相差显微镜荧光显微镜 实验步骤 | 一、实验步骤 1.大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管。 2.以D-Hanks’液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100ml酶消化液I(0.05%IV型胶原酶)。 3.待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20U/mlDNaseI的0.05%IV型胶原酶)消化15min，尼龙网过滤后以450g离心5min(4℃，下同)。 4.以HBSS重悬沉淀至10ml，再混以20mlNycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3mlHBSS，1450g离心16min后取界面细胞。 5.以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105 细胞/cm2 )，次日换液，以后每2-3天换液一次。 6.传代方法：弃去培液后以D-Hanks’液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05%EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5min左右)，以完全培液(DMEM+10%NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。附照片(图1)。
图1.原代培养第2天的大鼠肝星状细胞 其他 | 一、讨论 进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin 和α-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(最好5代以内)。 二、文献 1.袁桃霞，张锦生，张月娥，等.大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察.上海医科大学学报,1996,23(2):90-93. 2.HuangGC,ZhangJS,TangQQ.InvolvementofC/EBP-αgeneininvitroactivationofrathepaticstellatecells.BiochemBiophysResCommun,2004,324(4):1309-1318. |
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发布于 ： 2021-09-17
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