材料与设备

过表达σ³²的大肠杆菌细胞株〔BL21(DE3)/pLysS,pLHN16〕

氯霉素

氨苄青霉素

异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)

利福平

OakRidge离心管（40-ml)

带刻度的聚丙烯锥形离心管（50-ml)

Tissue-Tearor^TM匀浆器（FisherScientific15-338-55)

超声破碎器

试剂

LB培养基

SDS样品缓冲液（2X)

脱氧胆酸钠（DOC)(20%储液)

(配方，见"试剂的配制"，PP.184~189)

操作程序

原材料的制备

本单元所用的大肠杆菌细胞株〔σ³²的过表达质粒为pLHN16,宿主菌为BL21(DE3)/pLysS〕是按Nguyen等（1993)所述方法构建的〔参见Nuvagen公同出版的pETTMSystemManual(Novagen,Inc.1995)中关于pETll表达系统的应用〕。

1)大肠杆菌于37°C摇瓶培养，摇瓶体积为2000-ml，每瓶装500mlLB培养基，在氯霉素（25ug/ml)/氰苄青霉素（100ug/ml)的选择压力下，培养至A_550nm达0.9。

2)加IPTG,至终浓度为1mmol/L,诱导T7RNA聚合酶表达。诱导0.5h后，加利福平至终浓度为150ug/ml,以获得最大程度的过表达。

3)加利福平后3.5小时结束培养，4°C、8000r/min离心30min,收集细胞。将毎升培养液所得的细胞沉淀物重悬于30mlLB培养基，再用40-mlOakRidge离心管，4°C、13000r/min离心10min。细胞用干冰速冻，储存于-70°C备用。
注：本单元所用的细胞虽是冻存的，但对于未知的蛋白质，用新鮮细胞制备要安全得多，特别是需要重折叠的话。细胞冻存最好不超过5d(天）。

为监测纯化操作步骤的取样

为监测纯化的进程和效果，有必要在每个纯化阶段对每个组分进行下列操作步骤。

1)测量体积。
注：一个非常便捷的办法是，对所用的各种大小的试管例如：Eppentbrf管、OakRidge离心管等，细心地加H₂O并标出各体积所对应的水平线，准备好一套经过标定的管子，以用来快速测量溶液的体积。带刻度的锥形离心管也可方便地用于这一目的。

2)将一份36-ul的样品加入84ulSDS样品缓冲液(2X)中，70~90°C水浴加热2~5min,保存于4°C。

3)留取部分样品（150ul)供蛋白测定和免疫定量（inrnumo-quantitation)用。将上述信息记录在纯化记录表中，并以此编制纯化总结表。必须小心地留存好有代表性的样品。这就是说，应在临取样前将整个组分真正混合均匀。这一点对那些含有沉淀或重悬的不溶物质的组分来说尤为重要。为方便起见，在留取用于SDS凝胶电泳分析和蛋白质定量测定的样品时，可造一张表，列出样品A~J及其有关描述和体积，以及要检査的两种层析柱。在本单元中，还将指导你在不同的纯化阶段进行取样（如各实验中所述)，这些样品将用于纯化方案的补充实验，如本单元最后一节所述。

超声破碎细胞

1)取3g大肠杆菌细胞[BL21(DE3)/PLysS，pLHN16〕于室温下解冻。细胞经组织破碎器短暂匀浆后，重悬于20ml缓冲液A(置一40-ml的OakRidge离心管)中。
注：纯化σ³²时，缓冲液A中不加还原剂，因σ³²不含半胱氨酸残基。通常，所有缓冲液中都要加(0.1~0.5mmol/L二硫苏糖醇，以防蛋白质氧化。

2)用大超声头，设定8个循环和50%的时间间隔，在冰浴中超声90s。
注：BL21DE3细胞携带有表达T7溶菌繭的pLysS。不过，该溶菌酶不能从内側攻击细胞壁，故此基因不是致死的。当细胞冻融时，溶菌醅会接近细胞壁，使细胞裂解。在有些情况下，这足以使细胞破裂，但必须解决好因DNA释出而产生的粘度问题。一种方法是用相当大量的DNA酶I消化，但这可能是昂贵的，并对混合物又加入了一种蛋白质，因而可能引起更多的麻烦（例如，正在纯化DNA结合蛋白的话)。为此，为确保细胞完全玻碎，我们采用了超声处理法。这可在很大程度上切断DNA,使包涵体的沉淀变得较为容易。

3)加DOC,使终浓度为0.2%(即，加约240ul的20%DOC储液)。混匀，静置10min
注：1.0.2%DOC是用来帮助释出少量不溶性蛋白质的，在高浓度（2.0%)下则释出细胞膜的成分（见实验2)。DOC溶解得相当慢，因此，其储液应提前1天配制。2.若只想分离包涵体.不希望对上清中的可溶性蛋白质作进一步的分级分离（如下文的样品B),则可在这一步加DOC至终浓度2%,并略去实验2中所述的第二次DOC洗涤。

4)取第一个样品（样品A),如上所述见p.146)。

包涵体和可溶性提取物的制备

1)为沉淀包涵体，细胞裂解物用小转头（SorvallSS-34或BeckmanJA20),4°C、13000r/min离心10min。

2)轻轻倾出上清（取样品B)，冰上保存，供PEI沉淀和免疫亲和层析（IAC)纯化核心RNA聚合酶-P2复合物用（见实验3)。关于包涵体中的过表达的溶解和复性，见实验2。