铁蛋白免疫电镜实验一铁蛋白免疫电镜技术
| 实验方法原理 | 免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。 | ||||||
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| 实验材料 | 马脾铁蛋白 试剂、试剂盒 | 硫酸铵硫酸镉双异氰酸镉二甲苯硼盐酸缓冲液硫酸铵液 PBS蒸馏水 仪器、耗材 | 离心机显微镜微孔滤膜 实验步骤 | 一、材料与试剂准备 1. 马脾铁蛋白 2. 硫酸铵 3. 硫酸镉 4. 双异氰酸镉二甲苯(Metaxylenedlisocyante XC)：以0.30mol/LpH9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。 5. 0.30mol/LpH9.5硼盐酸缓冲液 6. 0.1mol/L硫酸铵液 7. 0.05mol/LpH7.4PBS液 二、操作方法 1. 铁蛋白的提取 （1）配制2%硫酸铵液，并以1mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。 （2）加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。 （3）1500g离心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。 （4）于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。 （5）检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。 （6）以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。 （7）重复步骤⑹一次。 （8）以少量蒸馏水溶解，常水透析24h后，以0.05mol/LpH7.5PBS透析24h。 （9）100000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。 （10）用微孔滤膜(孔径0.45μm)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存，以免铁蛋白结构遭破坏。 2. 铁蛋白－抗体交联 （1）以0.3mol/LpH9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。 （2）以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。 （3）以0.3mol/LpH9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48h。 （4）以0.1mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05mol/lpH7.5PBS透析，使pH值恢复到生理水平。 （5）超速离心 以1.00×105 g离心5h，去上清，沉淀以0.05mol/LPBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。 （6）以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。 3. 铁蛋白－抗体结合物处理标本 （1）将标本以5%福尔马林pH7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。 （2）用冷的PBS液洗涤，离心。 （3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20min，不时振荡。 （4）以冷PBS液洗涤三次，离心。 （5）沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。 （6）再以锇酸固定，脱水包埋。 也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下： （1）将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。 （2）PBS液洗涤离心。 （4）取出，切成小块，以PBS液洗涤。 （5）置干燥器中以硅胶干燥。 （6）包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。 （7）滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。 （8）5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。 （9）凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。水洗、晾干、电镜观察。 三、结果判定 在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。 |
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发布于 ： 2018-08-03
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