重组病毒的蛋白质分析实验一基本方案
| 实验材料 | Sf细胞 试剂、试剂盒 | 胎牛血清PBSSDS蛋白酶抑制剂裂解缓冲液 仪器、耗材 | 培养瓶培养箱离心机转子水浴锅 实验步骤 | 1. 接种2.5×108Sf9细胞于含5ml完全培养液/10%胎牛血清的25cm2培养瓶中，27℃温育≥2h。从含无血清完全培养液和重组蚀斑的1ml病毒贮液中取0.5ml分别加入各个培养瓶。4℃保存剩余的0.5ml重组病毒，待以后用于蚀斑试验。 2. 培养瓶置27℃温育4~5天，毎天检查感染迹象。4~5天后，将培养液转移至15ml离心管中，收获病毒。 3. 于4℃1000g离心10min，将含有扩增病毒的上清转移至一支无菌15ml聚丙烯离心管中。 4. 接种2.5×106Sf9细胞于含5ml完全培养液/10%胎牛血清的25cm2培养瓶中。为每―待测病毒贮液准备一个培养瓶，另准备一个作为非感染对照。27℃温育≥2h，使细胞贴壁。弃去细胞培养液并向培养瓶中加入1.5ml扩增的病毒贮液，27℃温育2天。 5. 从塔养瓶中轻轻移去细胞以收获之，并将细胞和培养液转移至15ml聚丙烯离心管中。 6. 于4℃，1000g离心10min，如果目的蛋白是分泌型蛋白质，将培养上清移至一新管，进行步骤8。如果待研究蛋白是胞内蛋白，则弃上清，用PBS轻轻将细胞团块重悬洗涤，重复离心并弃上清。 7. 直接加入500μl1×SDS样品缓冲液，煮沸细胞团块，如因DNA的存在造成样品太粘稠，可超声裂解样品，持续超声处理直到粘性消除，然后转至步骤9。另一变通方法是用0.5ml补充了蛋白酶抑制剂的适当裂解缓冲液裂解细胞团块，4℃微量离心10min，澄清裂解物，将上清转移至一个新管。取0.1ml的各种裂解物加至100μl2×SDS样品缓冲液中，在沸水浴中煮沸3min，剩余裂解物冻存于-80℃，可保存数月。 8. 用Bradford的方法，确定培养物上清中分泌蛋白（步骤6）的浓度或细胞裂解物中细胞内蛋白（步骤7）的浓度。 9. 用下列方法中的一种分析每一样品中的蛋白质： （1）免疫印迹：在单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，每一泳道加入20~40μg细胞总蛋白。记住要包括非感染对照。 （2）考马斯亮蓝染色：在单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，每一泳道加入20~40μg细胞总蛋白。如果重组病毒不纯，则只有在感染细胞中重组蛋白产量很高时才用此方法检测。 （3）功能分析：如迁移率变动的DNA结合分析，体外激酶分析（用于蛋白激酶），核苷结合分析（用于结合核苷的蛋白），胸苷掺入分析（用于生长因子蛋白质），或者任何用于检测目的蛋白的典型分析方法。 （4）重组蛋白的代谢标记。 10. 解释结果，以鉴定出哪一个假定的重组蚀斑是产生所需蛋白的重组子，将其进行蚀斑纯化，以使其免受任何野生型病毒污染。制备大量病毒毒种贮液，并测定重组病毒的滴度。 |
|---|
免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
发布于 ： 2018-08-03
阅读（162）
▍
相关分类
▍
相关文章
